反相高效液相色谱法测定利卡西平血药浓度

张国阳，何银舟，王 利（.淮安市第三人民医院，江苏 淮安 300；.淮安市楚州医院，江苏 淮安 399）

反相高效液相色谱法测定利卡西平血药浓度

张国阳1，何银舟2，王 利1（1.淮安市第三人民医院，江苏 淮安 223001；2.淮安市楚州医院，江苏 淮安 223299）

目的：建立利卡西平血药浓度测定方法。方法：采用反相高效液相色谱法，色谱柱：Waters sunf i re C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水-三氟乙酸（600 : 400 : 0.5）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃；检测波长：230 nm；进样量：20 μL。内标物：盐酸赛庚啶。结果：以利卡西平与内标物峰面积之比（y）对利卡西平血清浓度（C）进行线性回归，得回归方程：C = 1.227×102y – 0.364（r2= 0.9996，n = 7），结果表明利卡西平在5.0 ～ 100.0 μg·mL-1范围内样品回收率高（平均回收率为99.80%，RSD = 1.25%）。结论：本方法操作简便、精密度好，可用于利卡西平的治疗药物监测。

利卡西平；反相高效液相色谱法；血药浓度；治疗药物监测

[KEY WORDS]Licarbazepine; RP-HPLC; Blood drug concentration; Therapeutic drug monitoring

卡马西平在治疗过程中易产生严重的副作用，其初级代谢产物奥卡西平能降低副作用，但疗效亦明显降低。奥卡西平的再代谢产物利卡西平亦具有抗癫痫作用。利卡西平由葡萄牙Bial制药公司开发，于2009年上市，FDA已批准该药用于癫痫部分发作的附加治疗。由于奥卡西平本身具有抗癫痫作用，口服后吸收迅速，代谢速度极快，在肝脏转化为真正起作用的利卡西平[1-2]，因此临床上对奥卡西平的量-效评价是通过对其活性代谢物利卡西平来实现，主要测定利卡西平而非奥卡西平。利卡西平血药浓度的测定方法国内外已有报道[3-7]，本文采用反相高效液相色谱法操作简便、速度快且重现性好，可用于利卡西平的治疗药物监测。

1 仪器与试药

1525-2489型高效液相色谱仪，包括Breeze型二维色谱软件，配7725i六通阀，20 μL定量环（美国Waters公司）；利卡西平（大连美仑生物技术有限公司分装美国Tocris Bioscience公司，纯度≥98%，批号：2A/153031）；盐酸赛庚啶（常州四药制药有限公司，纯度99.6%，批号：140225）。甲醇、乙醚、三氟乙酸均为色谱纯（均由江苏汉邦科技有限公司提供），氢氧化钠（上海试剂一厂，分析纯）、硼砂（宜兴试剂厂，分析纯）。奥卡西平片（曲莱，Novartis Farma S.p.A，规格：0.3 g，批号：T1880）；水为自制高纯水。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters sunf i re C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水-三氟乙酸（600 : 400 : 0.5）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃；检测波长：230 nm；进样量：20 μL。

2.2 对照液及内标液的制备

精密称取利卡西平标准品100 mg，溶解于甲醇并定容至100 mL，得利卡西平标准品储备液。精密量取储备液1 mL，加甲醇至100 mL，得10 μg·L-1利卡西平标准液。

精密称取盐酸赛庚啶标准品100 mg，溶解于甲醇并定容至100 mL，得盐酸赛庚啶内标储备液。精密量取储备液10 mL，加甲醇至100 mL，得100 μg·L-1盐酸赛庚啶内标液。

2.3 样品处理

取具塞离心管分别加入盐酸赛庚啶内标液10 μL，氮气流挥干。精密吸取血清样品1 mL，涡旋混合1 min，加入2 moL·L-1氢氧化钠-硼砂饱和溶液250 μL，涡旋混匀1 min，加乙醚3 mL，涡旋混合10 min后3000 r·min-1低温离心3 min，取上层液（油相）2.0 mL。下层液（水相）再加乙醚3 mL，涡旋混合10 min后3000 r·min-1低温离心3 min，取上层液（油相）3.0 mL。合并上层液（油相），于40 ℃水浴氮气流挥干，100 μL流动相复溶（涡旋混合1 min）。进样20 μL。色谱分析。

3 结果

3.1 专属性和系统适用性实验

取空白血清、空白血清 + 利卡西平 +内标、患者血清 +内标。按“2.3”项下操作，其色谱图见图1。利卡西平、盐酸赛庚啶的保留时间分别为4.28 min、5.72 min，利卡西平与盐酸赛庚啶分离度为3.31。理论塔板数按利卡西平、盐酸赛庚啶计算分别为2980、3250。

3.2 标准曲线及最低检测限

取具塞离心管分别加入利卡西平标准溶液，盐酸赛庚啶内标液10 μL，用氮气流吹干后，加入1 mL空白血清，使盐酸赛庚啶浓度为1 μg·mL-1，利卡西平浓度分别为5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、80.0、100.0 μg·mL-1，按“2.3”项下操作进行分析，建立利卡西平的标准曲线。以利卡西平与内标峰面积之比（y）对利卡西平血清浓度（C）进行线性回归，得回归方程C=1.227×102y– 0.364（r2= 0.9996，n= 7），结果表明利卡西平在5.0 ～ 100.0 μg·mL-1范围内线性关系良好。采用逐步稀释法，当信噪比（S/N）为3时，最低检测浓度为5.0 μg·mL-1。

3.3 稳定性实验

图1 HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

将已知浓度（30 μg·mL-1）的利卡西平血清样品分别置于室温避光保存8 h、4 ℃冷藏24 h、反复冻融3次、– 20 ℃冻存1周，分别测定其含量。结果表明：利卡西平血清样品稳定性良好（峰面积RSD值在±7%之内）。

3.4 方法精密度与相对回收率

取用空白血清配制的含5.0、30.0、100.0 μg·mL-1三种浓度的样品， 依“2.3”项下操作，以利卡西平与内标物峰面积之比在曲线上求出利卡西平的浓度，其结果见表1。

在第1天内测定3份样品，每种浓度测定5份，统计测定数据的RSD即为日内精密度。在2周内任选取5 d，每天测定以上3种浓度样品各5份，统计5 d间（包括第1天）测定数据的RSD，即为日间精密度，并以实测浓度与实际浓度之比计算回收率。详见表2。

表1 日间、日内精密度实验结果. n = 5Tab 1 Precision results of intra-day and inter-day. n = 5

表2 样品回收率. n = 5Tab 2 Recovery rate of samples. n = 5

3.5 精密度实验

取10 μg·mL-1利卡西平标准液，按“2.1”项下色谱条件，重复进样6次，每次20 μL，结果显示RSD值为0.95%，表明进样精密度较好。

3.6 重复性实验

取空白血清配制的含30.0 μg·mL-1样品，按“2.3”项下方法操作，测定利卡西平的浓度，重复6次，含量的RSD值为2.06%，表明本法的重复性良好。

3.7 干扰性实验

针对临床治疗用药，测试了神经科可能存在的联合用药情况。具体品种有苯巴比妥（tR= 3.75 min）、苯妥英钠（tR= 5.21 min）、拉莫三嗪（tR= 3.77 min）、卡马西平（tR= 6.11 min）；镇静催眠药：氯硝西泮（tR=6.22 min）、阿普唑仑（tR= 8.45 min）、艾司唑仑（tR=7.31 min）、咪达唑仑（tR= 13.37 min）、扎米普隆（tR=4.85 min）。与利卡西平及内标物均分离良好。

3.8 患者血浆中利卡西平的测定

患者Ⅰ，男性，26岁，体质量52 kg，2017年5月入院，诊断为部分型癫痫，服用奥卡西平0.3 g，bid，6 d后症状控制，第7天晨起服药前抽取肘静脉血3 mL。

患者Ⅱ，男性，51岁，体质量73 kg，2017年4月入院，诊断为部分型癫痫，服用奥卡西平0.45 g，bid，7 d后症状控制，第8天晨起服药前抽取肘静脉血3 mL。

取上述患者血清各1 mL，按“2.3”项下方法操作，测定患者血清中利卡西平浓度，每个血样测定一次，其结果分别为18.65 μg·mL-1和24.60 μg·mL-1。

4 讨论

4.1 临床意义

口服奥卡西平在肝细胞内芳基酮还原酶的作用下迅速转化为利卡西平。不同年龄段的癫痫患儿利卡西平稳态血药浓度差别大，同剂量奥卡西平，利卡西平的AUC值（剂量校正）在2 ～ 5岁的儿童中比在6 ～12岁的儿童中低约30.0%[7]。利卡西平血药浓度监测对于不良反应，尤其是对老人、儿童、孕妇、肾功能损害者等特殊患者更有意义[8-9]。当利卡西平的浓度超过35 μg·mL-1时，较易发生疲劳、头痛、头晕、嗜睡和低钠血症等不良反应。因此，监测利卡西平浓度有必要且比监测奥卡西平更具临床意义。

4.2 检测波长的确定

利卡西平结构中有两个苯环具有明显的紫外吸收。紫外扫描发现，在210 nm、254 nm及270 nm处有吸收峰，在210 nm波长处吸收度最大。但考虑210 nm与甲醇的最大截止波长205 nm比较接近，造成基线的扰动较大。在兼顾利卡西平和内标物的情况下，于230 nm处背景吸收度较小，测定物质吸收度相对均较大，色谱峰尖锐稳定，可用于定量。

4.3 内标物的选择

使用盐酸赛庚啶为内标，价廉易得，与常用抗癫痫药联用机会少。其内标物保留时间长于利卡西平，与其得到了良好的分离，与神经科常用药物（抗癫痫药、镇静催眠药）得到了良好的分离，提高了实验准确度，便于推广应用。

4.4 萃取剂

国外文献报道血浆药物提取采用固相萃取或用混合提取剂[10-11]，操作繁琐且费用昂贵。本文分别采用乙醚、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷和氯仿为提取剂，比较发现：乙醚沸点低，样品处理时间短，单次提取率较高（约80%）但欠稳定，二次提取，其提取率高且稳定；正己烷提取率最低，其余均不理想。同时考察了加入氧氧化钠溶液碱化血样对萃取率的影响。实验表明，碱化血样对利卡西平萃取回收率无显著影响，但对内标物盐酸赛庚啶有影响，碱化血样可使其萃取率高且稳定。故采用碱化血样乙醚二次萃取，取得了满意的结果。

4.5 流动相对利卡西平峰形、峰位的影响

甲醇与水的比例对峰位有影响，pH ＜ 5.8时，峰形尖锐且稳定。本文采用三氟乙酸定量配比，可提供酸性流动相且配制方法简单迅速。

4.6 有效血药浓度监测与临床疗效

目前尚无国际公认的奥卡西平治疗浓度参考值范围，国外有多个版本，如3 ～ 40[9]、12 ～ 30[12]、3 ～35 μg·mL-1[13]等。国内缺乏相关数据，有学者认为：对于大多数癫痫患者，控制利卡西平谷浓度大于8.5 μg·mL-1时对癫痫发作控制较好[6]。针对国人的利卡西平有效血药浓度范围仍需进一步研究。

综上所述，采用反相高效液相色谱法测定利卡西平的血药浓度，峰形稳定，操作简便，灵敏度高，重现性好，萃取率高，内标物价廉易得，结果准确可靠，可以作为一种检测方法应用于临床。

[1] Franceschi L, Furlanut M. A simple method to monitor plasma concentrations of oxcarbamazepine, carbamazepine, their main metabolites and lamotrigine in epileptic patients[J]. Pharmacol Res, 2005, 51(4): 297-302.

[2] 谢建伟，苏为科，周兆良.奥卡西平合成路线图解[J].中国医药工业杂志，2005，36（2）：123-125.

[3] Volosob A, Bialer M, Xiaodong S, et al. Simultameous streoselective high-performance liquid chromatographic determination of 10-hydroxycarbazepine and its metabolite carbamazipine-10, 11-trans dihydrodiol in human urine[J].J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 2000, 738(2): 419-425.

[4] Levert H, Odou P, Robert H. LC determination of oxcarbamazepine and its active metabolite in human serum[J]. J Pharm Biomed And, 2002, 28(3-4): 517-525.

[5] 付琳，邱相君，代宗顺，等.奥卡西平的人体相对生物利用度研究[J].中国药科大学学报，2004，35（3）：244-277.

[6] 张全英，徐文俊，俞蕴莉.高效液相色谱法测定癫痫患者血浆中奥卡西平活性代谢物的浓度及其血药浓度与疗效关系评价[J].中国生化药物杂志，2015，35（1）：106-109.

[7] 林志燕，刘海涛，舒扬，等.217例次癫痫患儿血清奥卡西平代谢物浓度监测分析[J].医药导报，2013，32（1）：12-14.

[8] Bring P, Ensom MH. Does oxcarbamazepine warrant therapeutic drug monitoring: a critical review[J]. Clin Pharmacokinet, 2008,47(12): 767-778.

[9] Bouquie R, Dailly E, bentue-Ferrer D. Therapeutic drug monitoring of oxcarbamazepine [J]. Therapie, 2010, 65(1): 61-65.[10] Bugamelli F, Sabbioni C, Mandrioli R, et al. Simultaneous analysis of six antiepileptic drugs and two selected metabolites in human plasma by liquid chromatography after solidphase extraction[J]. Anal Chin Acta, 2002, 472(1): 1-10.

[11] Qi ML, Wang P, Wang LJ, et al. LC method for the determination of oxcarbazepine in pharmaceutical preparations[J]. J Pharm Biomed Anal, 2003, 31(1): 57-62.

[12] Sims PJ. Applied pharmacokinetics pharmacodynamics principles of therapeutic drug monitoring[J]. Am J Phar Educ, 2006, 70(6): 148.

[13] Krasowski MD. Therapeutic drug monitoring of the newer antiepilepsy medications[J]. Pharmaceuticals, 2010, 3(6): 1909-1935.

The determination of licarbazepine concentration in patients' plasma by RP-HPLC

ZHANG Guo-yang1, HE Yin-zhou2, WANG Li1(1. Huai'an No.3 People's Hospital, Huai'an 223001, China; 2.Huai'an Chuzhou Hospital,Huai'an 223299, China)

Objective:To set up the HPLC method for determination of licarbazepine concentration in patient's plasma.Methods:The residues were analyzed by RP-HPLC method. Waters sunfire C18column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) was used,methanol-water-trifluoroacetic acid (600 : 400 : 0.5) was used as mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was set at 230 nm and the column temperature was 40 ℃ . The sample size was 20 μL. Cyproheptadine hydrochloride was used as internal standard.Results:Linear regression analysis was made by licarbazepine serum concentration (C) and the peak area ratio (y)of licarbazepine vs internal standard. The regression equation was C = 1.227 × 102y – 0.364 (r2= 0.9996, n = 7). The results showed that the recovery ratio of licarbazepine was high in the range of 5.0 – 100.0 μg·mL-1(average recovery rate = 99.80%, RSD = 1.25%).Conclusion:The method provided a simple and precise way for monitoring plasma concentration level of licarbazepine, and this method can be used for therapeutic drug monitoring of licarbazepine.

R917

A

1672 – 8157(2017)05 – 0267 – 04

何银舟，男，副主任药师，主要从事临床药学工作。

E-mail：czyyybk@163.com

张国阳，男，主任药师，主要从事临床药学工作。

E-mail：pharm_zhang@163.com

2017-02-10

2017-05-22）