通脑液的质量标准研究

王秀琴 ，钱秋玉，王东兴，石 蕾，陈 军（陆军总医院263临床部药剂科，北京 101149）

通脑液的质量标准研究

王秀琴 ，钱秋玉，王东兴，石 蕾，陈 军（陆军总医院263临床部药剂科，北京 101149）

目的：建立通脑液的质量标准。方法：采用薄层色谱法（TLC）对处方中西红花进行定性鉴别；采用HPLC法测定西红花中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的含量，色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm），甲醇-水（48∶52）为流动相，流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长440 nm，进样量10 μL。结果：薄层鉴别专属性强，分离效果好。西红花苷Ⅰ在9.66 ～ 57.94 µg·mL-1呈良好的线性关系（r = 1），西红花苷Ⅱ在5.91 ～ 35.48 µg·mL-1呈良好的线性关系（r = 0.9999），平均回收率分别为98.4%（RSD = 1.21%，n = 9），99.4%（RSD = 1.70%，n = 9）。结论：该方法简便、准确、重复性好，可作为通脑液的质量控制方法。

西红花；西红花苷Ⅰ；西红花苷Ⅱ；高效液相色谱法

[KEY WORDS]Saffron; Crocin Ⅰ; Crocin Ⅱ; HPLC

通脑液由西红花、石菖蒲、川芎、水蛭等九味药材研制而成，主要用于治疗脑梗死、脑缺血、脑卒中恢复期、脑外伤及脑炎后遗症、脑瘫等症状。原标准中鉴别川芎[1]、西红花不足以控制通脑液的质量，增加该制剂中石菖蒲、水蛭的薄层鉴别，以更好的控制本品质量，该实验另文有报道。国内外大量研究表明，西红花提取物在抗心血管系统疾病、抗氧化、抗动脉粥样硬化、防治糖尿病并发症等方面有明确的生物活性[2-3]。本实验采用薄层色谱法（TLC）对处方中君药西红花进行定性鉴别；采用高效液相色谱法（HPLC）测定西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的含量，作为通脑液的质量控制指标。

1 仪器与试药

Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；BT125D型电子天平（德国赛多利斯公司）；色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5µm）；LDZ5-2型离心机（北京京立离心机有限公司）；ZF-2型紫外灯（上海嘉鹏科技有限公司）；851-2型远红外快速干燥箱（上海向阳无线电元件厂）。甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；纯化水（自制）；西红花苷Ⅰ对照品（中国食品药品检定研究院，纯度：91.1%，批号：111588-201202，本品需冷冻遮光保存，使用前无需处理）；西红花苷Ⅱ对照品（中国食品药品检定研究院，纯度：92.4%，批号：111589-201304，本品需冷冻遮光保存，使用前无需处理）。 通脑液（解放军第二五五医院配制，每支8 mL，批号：20141117、20150309、20150415）。

2 方法与结果

2.1 西红花TLC鉴别

取西红花对照药材0.02 g，加甲醇4 mL，密塞，振摇，静置30 min，取上清液作为药材对照溶液。再另取缺西红花的通脑液阴性样品10 mL，浓缩至约2 mL，作为阴性对照溶液。吸取上述三种溶液各5 µL，分别点于同一硅胶G薄板上，以醋酸乙酯-甲酸-水（5 : 1 : 0.6）的上层溶液为展开剂，展开检视。实验表明，供试品溶液在与对照药材色谱相应的位置上，显相同黄色的荧光斑点，阴性样品未见干扰。

2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇-水（48 : 52）；检测波长：440 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样体积：5 µL；理论塔板数按照西红花苷Ⅰ峰计算应不低于3500。

2.3 溶液的制备

（1）西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ对照品溶液的制备：取西红花苷Ⅰ对照品10 mg，精密称定，置50 mL量瓶中加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得西红花苷Ⅰ对照品储备液。精密量取1 mL西红花苷Ⅰ对照品储备液置10 mL量瓶中加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得西红花苷Ⅰ对照品溶液（10 ℃以下保存）。再另取西红花苷Ⅱ对照品12 mg，精密称定，置100 mL量瓶中加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得西红花苷Ⅱ对照品储备液。精密量取1 mL西红花苷Ⅱ对照品储备液置10 mL量瓶中加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得西红花苷Ⅱ对照品溶液（10 ℃以下保存）。精密量取西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ对照品储备液各1 mL于10 mL量瓶中稀释至刻度，摇匀，即得（10 ℃以下保存）。（2）供试品溶液的制备：精密量取本品1 mL于10 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，摇匀，即得。（3）阴性样品溶液的制备：精密吸取缺西红花的通脑液阴性样品1 mL置10 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，摇匀，即得。

2.4 系统适用性实验

分别精密吸取“2.3”项下对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各5 µL，按“2.2”项下色谱条件进样。结果显示，在西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ[4]对照品色谱峰的保留时间处，供试品溶液具有色谱峰，且色谱峰与相邻峰得到基线分离，而阴性样品溶液没有色谱峰，共存的其他药味对测定没有干扰，表明该方法对通脑液中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的测定具有专属性。对照品、供试品及阴性样品色谱见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 方法学验证

2.5.1 线性关系考察 精密称取西红花苷Ⅰ对照品10.60 mg置于50 mL量瓶中加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为西红花苷Ⅰ对照品储备液。再分别精密量取西红花苷Ⅰ对照品储备液0.5、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0置10 mL量瓶中；精密称取西红花苷Ⅱ对照品12.80 mg置于100 mL量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为西红花苷Ⅱ对照品储备液。再分别精密量取西红花苷Ⅱ对照品储备液0.5、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0分别置上述10 mL量瓶中，用稀乙醇定容，摇匀，即得系列浓度西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ对照品混合溶液。分别精密吸取西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ对照品系列浓度混合溶液各5 µL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。实验表明，西红花苷Ⅰ在9.66～ 57.94 µg·mL-1浓度范围内峰面积与进样浓度的关系为：A= 26.717C– 0.0693（r= 1），西红花苷Ⅱ在5.91 ～35.48 µg·mL-1浓度范围内峰面积与进样浓度的关系为：A= 28.673C– 7.1746（r= 0.9999），表明西红花苷Ⅰ在9.66 ～ 57.94 µg·mL-1范围内线性关系良好，西红花苷Ⅱ在5.91 ～ 35.48 µg·mL-1范围内线性关系良好。

2.5.2 精密度实验 按“2.3”项下方法配制西红花苷Ⅱ对照品储备液。分别精密吸取上述储备液各1.0 mL于10 mL量瓶中，用稀乙醇定容，摇匀，即得。进样，按“2.2”项下方法进行分析，重复进样6次，记录色谱图，计算峰面积的RSD。实验表明，西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ峰面积的RSD分别为0.36%（n= 6）和1.02%（n= 6），表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性实验 取同一批样品（批号：20150415）6份，按“2.3”项下方法制备，依法测定，记录色谱图。实验结果表明，通脑液中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ含量平均值分别为131.24 µg·mL-1（RSD = 1.02%，n= 6）和50.17 µg·mL-1（RSD = 1.75%，n= 6），表明该方法重复性良好。

2.5.4 稳定性实验 取同一批样品（批号：20150415）制备的供试品溶液，分别于0、2、4、6、10、12 h进样测定。实验结果表明，通脑液中西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ峰面积的RSD分别为0.47%（n= 6）和1.79%（n=6），表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.5.5 回收率实验 精密称取西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ对照品稀释制成浓度分别为93.29 g·mL-1和56.62 g·mL-1的加样用西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ溶液。分别取0.8、1.0、1.2 mL加样用西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ溶液按低（80%）、中（100%）、高（120%）三个剂量组置于10 mL量瓶再分别精密称取同一批已知含量的样品（批号：20150415）9份，每份0.5 mL，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀后依法测定，记录色谱峰值。结果表明该法适用于西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ含量测定，见表1。

表1 西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ加样回收率实验结果. n = 9Tab 1 Results of recovery test for crocinⅠand crocinⅡ. n = 9

2.6 含量测定

取通脑液三批样品（批号：20141117；20150309；20150415）按供试品溶液制备方法项下制备，依法测定峰面积，按外标法计算西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的含量[5-7]。测定数据与结果见表2。

表2 西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ含量测定结果. n = 3Tab 2 Contents determination of crocinⅠand crocinⅡ. n = 3

3 讨论

3.1 通脑液指标成分及含量测定方法的选择

君药之一西红花为鸢尾科植物番红花（Crocus sativus L.）的干燥柱头，性味甘、平，归心、肝经，具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神的功效[1]。国内外大量研究表明，西红花提取物在抗心血管系统疾病、抗氧化、抗动脉粥样硬化、防治糖尿病并发症等方面有明确的生物活性[2-3]，其药理作用明显，开发潜力大，颇受医药界青睐。2010年版《中国人民解放军医疗机构制剂规范》未对通脑液进行含量测定，及未对制剂中组成成分石菖蒲、水蛭进行鉴别。 根据《中国药典》[3]、参考相关文献[4-8]及课题专家审批建议，选定处方组成中的君药西红花的有效成分西红花苷Ⅰ、Ⅱ作为指标成分，采用HPLC法对其进行含量测定，本实验所建立的方法操作简便、专属性强，精密度、重复性、回收率均满足要求，可作为通脑液的质量控制方法。

3.2 通脑液含量限度的确定

本制剂为中药制剂，进行含量限度测定须注意：在保证药物成分对临床安全和疗效稳定的情况下，并基于足够的具有代表性的样品实验数据，结合药材含量及工艺收率综合分析制定。我们所测成分的原料为粉末、提取物入药，该成分的转移率应不低于85%，且所测成分的原料在制备工艺中经溶剂提取时，该成分转移率一般应不低于30%。

3.3 HPLC法测定条件的优化

3.3.1 检测波长选择 参考文献[5,9]并采用二级管阵列检测器（DAD）进行全波长扫描显示，西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ在440 nm波长范围处有最大吸收，因此选择440 nm作为检测波长。

3.3.2 流动相的选择 经过多次实验确定了以甲醇-水（48 : 52）为西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ含量测定的流动相，峰形好，西红花苷Ⅰ理论塔板数达5000以上，可作为通脑液的质量控制方法。由于西红花苷Ⅰ、Ⅱ的结构中有多个共轭双键，对pH、光照、温度、氧等影响因素十分敏感，稳定性差[2,7]，因此在实验中应保持温度不变，所以选择柱温与外界温度相一致。

[1] 张业昊，丛伟红，刘建勋.西红花苷的药理作用研究进展[J].中药药理与临床，2015，31（2）：124-127.

[2] 钱勇，许纪锋，诸晨，等.西红花中西红花苷Ⅰ和苷Ⅱ的含量测定[J].食品安全质量检测学报，2015，6（7）：2822-2827.

[3] 国家药典委员会.中国药典[S].北京：中国医药科技出版社，2010：120.

[4] Caballero-Ortegaa H, Pereda-Mirandab R, Abdullaeva FI. HPLC quantification of major active components from 11 different saffron (Crocus sativus L.) sources[J]. Food Chem, 2007, 100:1126-1131.

[5] Si W, Yang W, Guo D, et al. Selective ion monitoring of quinochalcone C-glycoside markers for the simultaneous identif i cation of Carthamus tinctorius L. in eleven Chinese patent medicines by UHPLC/QTOF MS[J]. J Pharm Biomed Anal, 2016,117: 510-521.

[6] Sang GL, Vance TM, Nam TG, et al. Evaluation of pH differential and HPLC methods expressed as cyanidin-3-glucoside equivalent for measuring the total anthocyanin contents of berries[J]. J Food Meas Charact, 2016, 10(3): 1-7.

[7] 邓绍勇，贺义昌，朱培林，等.栀子野生群体栀子苷及西红花苷-1含量分析[J].中药材，2016，39（7）：1493-1498.

[8] 沈健，张诚贤.HPLC梯度洗脱法同时测定小儿暑感宁糖浆中的香荆芥酚、麝香草酚、和厚朴酚及厚朴酚[J].中国药物应用与监测，2016，13（4）：217-220.

[9] 韩亚亮，古今，何新荣，等.HPLC法测定血塞通软胶囊中三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量[J].中国药物应用与监测，2015，12（5）：268-271.

Quality standard studies of Tongnaoye

WANG Xiu-qin, QIAN Qiu-yu, WANG Dong-xing, SHI Lei, CHEN Jun(Pharmacy of 263 Clinical Department of the Army General Hospital, Beijing 101149, China)

Objective:To establish the quality standard of Tongnaoye.Methods:Thin layer chromatography (TLC) was used to identify crocus sativus in the prescription. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine the content of crocin Ⅰ and crocin Ⅱ. Chromatographic conditions were as follows: Agilent ZORBAX SB-C18column (250 mm × 4.6 mm,5 µm) was used, the mobile phase consisted of methanol-water (48 : 52) with the fl ow rate of 1.0 mL·min-1, the detection wavelength was set at 440 nm, the temperature was 30 ℃ and the sample volume was 10 μL.Results:The TLC method showed good specif i city and separation effect. CrocinⅠshowed a good linear relationship (r = 1) in the range of 9.66 – 57.94 µg·mL-1, while crocinⅡ showed a good linear relationship (r = 0.9999) in the range of 5.91 – 35.48 µg·mL-1. Their average recovery rates were 98.4% (RSD = 1.21%, n =9) and 99.4% (RSD = 1.70%, n = 9) respectively.Conclusion:This method was simple, accurate and reproducible, which could be used to control the quality of Tongnaoye.

R917

A

1672 – 8157(2017)05 – 0271 – 04

军队十二五面上项目（14ZJZ06-1）

王东兴，男，主管药师，研究方向：药品分析与药品质量控制。E-mail：13910864566@139.com

王秀琴，女，副主任药师，主要从事药事管理及临床药学工作。E-mail：wangxq69@163.com

2017-04-10

2017-06-06）