Borna病病毒与病毒性脑炎及精神分裂症的关系

张 丽 刘 玫 徐 平 蒋国红

(遵义医学院附属医院神经内科，贵州 遵义 563000)

Borna病病毒与病毒性脑炎及精神分裂症的关系

张 丽 刘 玫 徐 平 蒋国红

(遵义医学院附属医院神经内科，贵州 遵义 563000)

目的探讨Borna病病毒(BDV)与精神分裂症(SCH)及病毒性脑炎(VE)发病的关系。方法对来自遵义市、毕节地区等贵州省部分地区的健康人100例、SCH患者30例、VE患者62例的外周血单核细胞(PBMC)采用巢式逆转录荧光定量PCR法检测是否存在BDVp24基因片段，并纯化、克隆阳性产物，对阳性产物测序并进行同源性分析。结果BDVp24基因片段在VE〔6.5%(4/62)〕与健康人(0%)中的阳性率比较差异有统计学意义(P<0.05)，但健康人与SCH患者阳性率〔6.7%(2/30)〕比较无显著差异(P>0.05)。SCH患者与VE患者经检测之后存在完全相同的测序结果，相较于GenBank提供的Strain V毒株、C6BV毒株、1766毒株和He80/FR病毒株存在3%、3%、2%和3%的突变率，其中有3个、3个、2个和3个位点发生一致的基因沉寂性突变，BDV与1766毒株最相似，SCH患者的临床表现与VE患者的临床表现相似。结论遵义市、毕节地区等贵州省部分地区VE的发生率可能与BDV感染有关。BDV p24基因片段未在健康人中检出。

Borna病病毒；精神分裂症；病毒性脑炎

Borna病病毒(BDV)是一种中枢神经系统的嗜神经病毒，BDV感染可引起脑脊髓炎，出现精神行为异常〔1〕。马类最容易被感染，还可以感染鸟类及驴、骡、羊、牛和猫等动物，人类也有被感染的报道，虽然病例数相对较少，但仍需要医护人员予以高度重视〔2〕。许多国外学者对BDV与病毒性脑炎(VE)及精神分裂症(SCH)的关系进行了研究，但多集中于牲畜，关于人BDV感染的研究较少〔3〕。本文通过检测SCH和VE患者及健康人的外周血单核细胞(PBMC)是否存在BDVp24基因片段，并纯化、克隆阳性产物及对阳性产物测序和同源性分析，试图探明其感染途径，以期为疾病的早期诊断、治疗及疫苗研制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1研究对象 选择2010年1～7月经遵义医学院附属医院收治的来自遵义市、毕节地区的VE患者62例，男35例，女27例，年龄14～76〔平均(32.84±10.23)〕岁；同期经遵义市优抚医院收治的来自遵义市、毕节地区的SCH患者30例，男14例，女16例，年龄19～63〔平均(43.84±7.62)〕岁。纳入标准：(1)VE患者经临床症状、脑脊液生化和常规检测、脑电图检查等方式明确诊断；(2)SCH患者按照中国精神障碍分类与诊断标准第3版(CCMD-Ⅲ)的诊断标准，患者临床症状及表现符合SCH临床诊断标准；(3)入选患者一般人口学资料完整，采集的标本满足本研究中的所有检测项目。排除标准：合并其他疾病(可能影响检测结果，如细菌及真菌性脑炎、药物或精神活性物质所致精神障碍)者。同期在遵义医学院附属医院或遵义市优抚医院进行体检的健康人100例，男50例，女50例，年龄21～64〔平均(44.87±5.94)〕岁。VE、SCH患者及健康人的性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2主要仪器与试剂 ABI 7500荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)、微量加样器(德国Eppendorf公司)、逆转录仪(美国应用生物系统公司)。荧光探针、内、外引物在中山医科大学达辉基因诊断中心合成。荧光探针：3′标记的是4-甲基罗达明(TAMRA)，5′标记的是62羧基荧光素(FAM)。

1.3方法 为了防止各种试剂及标本的污染，严格按消除RNase的常规方法对所有涉及RT2PCR实验的用品进行处理。抽取每位研究对象外周血5 ml，常规处理后采用Ficoll-conray液分离出PBMC，采用Tripure RNA提取试剂盒(购于北京博凌科为生物科技有限公司)提取细胞总RNA，已经提取的RNA标本置-70℃冰箱保存。将RNA按照逆转录试剂盒(蓝博生物技术有限公司提供)中提供的方法进行逆转录，将产物置-20℃冰箱保存。

1.4BDV质粒标准曲线制备方法 以阳性模板为阳性重组质粒，定量、稀释之后形成102、103、104、105的浓度梯度，PCR扩增采用ABI Prism 7500 型扩增检测仪，PCR产物定量实时监测设置为每间隔8 s进行一次，最终获取PCR扩增动力学曲线。以首先获得数据的自然对数作为横坐标，以Ct值为纵坐标，获得定量标准曲线，斜率、截距和相关系数依次为-3.389 078、45.098 53和0.996 475。

1.5巢氏逆转录荧光定量PCR 共分2轮，第一轮行常规PCR，第二轮行荧光定量PCR，在第二轮扩增的PCR反应混合物中加入荧光探针及第一轮产物。

1.6阳性BDV P24基因片段处理 首先采用醋酸钠乙醇沉淀法对PCR产物进行纯化，然后将纯化后的产物与pMD1-T载体进行连接，再用大肠杆菌进行转化，采用蓝白斑法对重组子进行筛选，并收集每一标本的阳性菌落进行培养。采用FQ-PCR对提取后的质粒DNA进行鉴定，再对阳性质粒进行测序。

1.7统计学方法 应用SPSS16.0统计软件行χ2检验。

2 结 果

2.1BDVp24 基因片段的检测率 VE患者BDVp24基因片段阳性率〔6.5%(4/62)〕明显高于健康人(0例，P<0.05)；SCH患者中虽也有阳性检出者，但由于阳性率较低〔6.7%(2/30)〕，但与健康人比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2BDVp24 基因片段序列测定结果 与国外标准株和流行株(GenBank提供)进行同源性分析，分析时采用基于局部比对算法的搜索工具(BLSAT)软件，分析结果显示阳性产物均证明为BDVp24基因片段，SCH患者与VE患者的测序结果一致，相较于Strain V毒株(GenBank提供)存在3%的突变率，其中3个位点发生一致性沉寂突变(nt1674 C-T，nt1671C-T，nt1650 T-C)；相较于C6BV毒株存在3%的突变率，其中3个位点发生一致性沉寂突变(nt1671 C-T，nt1668 A-G，nt1659 T-C)；相较于1766毒株存在2%的突变率，其中的nt1678 T-C和nt1675 C-T 2个位点发生一致性沉寂突变；相较于He80/FR病毒株存在3%突变率，其中的nt1672 C-T，nt1669 A-G和nt1660 T-C 3个位点发生一致性沉寂突变。相比之下，此次检测的BDV阳性BDVp24基因片段与1 766毒株最相似。见图1，图2。

6例呈S型曲线(阳性)，SCH为②③；VE为①④⑤⑥ 图1 FQ-nRT-PCR检测VE与SCH患者PMBCs中BDV RNA 的荧光Rn循环数变化曲线

Strain V(核苷酸序列号：AJ311521)，H1766(核苷酸序列号：AJ311523)，He80/FR(核苷酸序列号：AJ311522)图2 VE及SCH患者BDV p24核苷酸序列结果及与马BDV p24核苷酸序列(86bp)比较

2.3阳性患者临床表现 BDVp24基因片段阳性的SCH患者与VE患者的临床表现具有相似性，即均有精神行为的异常。SCH患者出现精神行为异常是毋庸置疑的；而4例VE患者临床表现不同程度精神异常，有些烦躁不安、言语增多、胡言乱语，有些情感淡漠、不语、不动，有些有幻觉及被害妄想，有些甚至有冲动攻击行为，只是SCH患者的精神症状更严重。

3 讨 论

BDV属于中枢神经系统新发病毒中的一种，动物和人感染该病毒后主要表现为精神行为异常，主要病理改变为边缘系统中积聚特异性抗原及炎性细胞浸润脑膜及脑细胞〔4〕。德国的Rott于1985年通过荧光抗体法在SCH症患者身上检测出脑脊液BDV抗体〔2〕，进而人们认识到BDV可能感染人类。临床研究中不少VE患者出现精神行为异常，但他们的病因一直未能明确，后来发现BDV感染的马与这些精神行为异常的脑炎患者临床表现极为相似，于是猜想BDV感染与不明原因的VE有关？较城市居民而言，农村居民中VE患者的发病率较高，其原因是农村居民与动物接触机会较多，所以猜想人类感染BDV较理想的模型是VE〔5〕。有研究〔6〕指出我国约2%～13%的神经精神疾病患者有BDV感染，而不同地区BDV感染率呈现出较大的差异。

本研究中，VE患者BDVp24基因片段阳性率高于健康人，原因可能为〔7～11〕：(1)收集的标本并不是在VE疾病高峰时的标本，即不同检测时间呈现出不同的检出率；不同的标本类型有不同的检出率，脑脊液通常比外周血阳性率高一点，而本次的标本是外周血。(2)检测差异可能也与检测方法有关。(3)不同区域存在不同生活习惯与生活方式，与动物接触的概率存在差异，其感染BDV的可能性也不同。(4)在实际操作中分离PBMC技术水平低、标本保存不合理、操作细节处理不细致等个人原因促使RNA降解，进而对检测BDVp24基因片段造成影响〔12〕。

1Cloes R，Ahmad A，Reintjes R.Risk communication during the 2009 influenza A(H1N1)pandemic：stakeholder experiences from eight European countries〔J〕.Disaster Med Public Health Prep，2015；9(2)：127-33.

2陈 静，徐 平.博尔纳病病毒的生活周期〔J〕.贵州医药，2015；39(7)：658-60.

3Scordel C，Huttin A，Cochet-Bernoin M，etal.Borna disease virus phosphoprotein impairs the developmental program controlling neurogenesis and reduces human GABAergic neurogenesis〔J〕.PLoS Pathog，2015；11(4)：e1004859.

4姚能云，佘艳梅，周红勤，等.以精神行为异常起病的脑炎患者与博尔纳病病毒感染的关系〔J〕.中华神经科杂志，2015；48(4)：307-11.

5叶绪芳，赵苏晔.贵州省农村地区病毒性脑炎感染现状研究〔J〕.中国卫生标准管理，2016；7(17)：9-11.

6陈 静，徐 平，刘海军.病毒性脑炎患者脑脊液博尔纳病病毒p40基因片段的检测〔J〕.中国实用神经疾病杂志，2016；19(3)：1-3.

7Honda T.Neuropathogenesis of persistent infection with Borna disease virus〔J〕.Uirusu，2015；65(1)：145-54.

8刘海军，谢祖勤，郭 霞，等.贵州部分地区精神分裂症患者血清PBMC博尔纳病病毒CIC及抗体的检测〔J〕.贵州医药，2015；39(3)：203-6.

9Ferré CA，Davezac N，Thouard A，etal.Manipulation of the N-terminal sequence of the Borna disease virus X protein improves its mitochondrial targeting and neuroprotective potential〔J〕.FASEB J，2016；30(4)：1523-33.

10雷以会，徐 平，杨利玲.贵州遵义地区82只健康蝙蝠脑组织博尔纳病毒核蛋白检测〔J〕.山东医药，2016；56(11)：23-5.

11McHugh JM，de Kloet SR.Discrepancy in the diagnosis of avian Borna disease virus infection of Psittaciformes by protein analysis of feather calami and enzyme-linked immunosorbent assay of plasma antibodies〔J〕.J Vet Diagn Invest，2015；27(2)：150-8.

12杨利玲，雷以会，徐 平.贵州遵义地区蝙蝠脑组织BDV-P24基因片段的检测〔J〕.中国人兽共患病学报，2016；32(2)：156-9.

〔2017-07-11修回〕

(编辑 袁左鸣)

R749

A

1005-9202(2017)19-4772-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.035

国家自然科学基金资助项目(No.31160210)

徐 平(1963-)，男，博士，主任医师，主要从事神经内科研究。

张 丽(1981-)，女，硕士，主治医师，主要从事神经内科研究。