肥胖小鼠良性前列腺增生模型的建立

向玖琳 王 茹 陈 廷 杨 钦 刘向云

(上海市人类运动能力开发与保障重点实验室 运动健身科技省部重点实验室 上海体育学院，上海 200438)

肥胖小鼠良性前列腺增生模型的建立

向玖琳 王 茹 陈 廷 杨 钦 刘向云

(上海市人类运动能力开发与保障重点实验室 运动健身科技省部重点实验室 上海体育学院，上海 200438)

目的构建肥胖小鼠良性前列腺增生的动物模型。方法SPF级C57BL/6J小鼠28只,取8只小鼠作为对照组(C组)喂养普通饲料，剩余的20只小鼠为高脂诱导肥胖组(Dio组)喂食高脂饲料，构建肥胖小鼠良性前列腺增生的模型。酶联免疫法检测血糖血脂、血清雌二醇(E2)和睾酮(T)；水取代法检测前列腺体积；HE染色检测前列腺组织病理变化；IPP图像分析软件统计前列腺腺腔面积和上皮高度。结果实验第9周，高脂喂养后有12只小鼠达到肥胖标准(为Ob组)，肥胖率为60%。Ob组小鼠体重、内脏脂肪重量明显大于C组(P<0.05)，前列腺重量、前列腺指数、体积、面积和上皮高度明显大于C组(P<0.05)；Ob组E2水平高于C组(P>0.05)，T水平低于C组(P>0.05)，而雌雄激素(E2/T)比值Ob组大于C组(P<0.05)；前列腺组织病理切片显示Ob组小鼠前列腺发生增生的病理变化。结论肥胖小鼠发生了前列腺增生。

肥胖小鼠；良性前列腺增生；前列腺体积；前列腺指数

良性前列腺增生(BPH)是老年男性最常见的疾病之一,年龄、生活方式等是BPH的重要原因,60～69岁的男性BPH发病率为70%，70岁以上的男性BPH的发病率为80%〔1〕。因此，探索BPH的发病机制，对提高老年男性的生活质量具有重大意义。国内外多项研究发现肥胖与BPH密切相关，体重、身高、腰围以及腰臀比是BPH的风险因子〔2～4〕。体质量指数(BMI)较高的男性人群BPH发生率较高，BMI每增加1 kg/m2,前列腺总体积增加0.41 ml〔3,5〕。据查阅文献，目前尚未见研究报道肥胖BPH的小鼠模型。因此，建立一种理想的肥胖患者前列腺增生的动物模型，对肥胖BPH的发生机制探索，药物研发和运动干预疗法等研究有重大的意义。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级C57BL/6J小鼠28只,雄性，体重(16.16±0.90)g，4周龄，购自上海灵畅生物科技有限公司〔SCXK(沪)2013-0018〕。饲养条件:SPF级动物房(合格证号：SYXK(沪)2014-0002)，室温21℃～23℃，湿度40%～60%，12 h明暗循环，每笼4只共7笼，自由进食水。

1.1.2主要试剂、仪器 Mouse Blood Glucose ELISA Kit(Catalog#CK-E00592M)，HDL and LDL/VLDL Quantitation Kit(Catalog#MAK045-1KT)，Triglyceride Quantification Colorimetric/FluorometricKit(Catalog#K622-100),Estradiol Parameter Assay Kit(Catalog#KGE014),Testosterone Parameter Assay Kit(Catalog #KGE010)均购自上海优宁维生物科技有限公司；BioTek EON酶标仪(BioTek Corporation,Vermont,USA) ；BX53F显微镜(Olympus Cooperation,Tokyo,Japan)。

1.2方法

1.2.1小鼠分组及模型制作 适应性喂养1 w，一般情况下，高脂喂养8 w后有40%的小鼠可达到肥胖标准〔6〕，肥胖标准〔7〕：肥胖建模组体重超过对照组体重平均值20%。因此，根据3R原则以及肥胖成功率，取8只作为对照组(C组)，体重(17.79±0.86)g，给予普通饲料喂养，剩余的20只小鼠作为高脂诱导肥胖组(Dio组)，体重(18.01±0.84)g，给予60%高脂饲料，以期有8只(即20×40%=8只)小鼠达到肥胖标准,每周进行小鼠称重，连续8 w。普通饲料购于上海杰思捷实验动物有限公司。高脂饲料(D12492,Research Diets Company,CAN)购自福贝世亨生物医药(上海)有限公司，能量供应比kcal%：蛋白质20%、糖类20%、脂肪60%。

1.2.2解剖取材 第9周末称重，Dio组高脂喂养后有12只小鼠达到肥胖标准，肥胖率为60%，作为肥胖模型组(Ob组)。剔除8只肥胖造模不成功的小鼠，Ob组取8只(其余4只肥胖小鼠以备后续实验进行运动干预)和C组8只小鼠进行解剖取材。在取血前一晚禁食12 h，眼眶取血，4℃，3 000 r/min低温离心15 min，吸取血清储存于-80℃备用。然后取肝脏周围脂肪和附睾脂肪，内脏脂肪水分吸干后称重。解剖前列腺组织水分吸干称重,计算前列腺指数(前列腺重量mg/小鼠体重g)，并用水取代法测量前列腺组织体积〔8〕，即用两个滴管和一根橡胶管制作成“U”型管，注入生理盐水至统一刻度，当放入前列腺组织至一侧后并调回至以前刻度，用对侧上升的刻度减去原来统一的刻度即为前列腺体积值。然后取出前列腺组织固定于4%的多聚甲醛。

1.2.3血清指标检测 采用酶联免疫吸附法检测血清中甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、睾酮(T)、雌二醇(E2)水平。

1.2.4前列腺组织病理学检查 小鼠前列腺切片，厚度4 μm，苏木素-伊红染色(即HE染色)，切片用Olympus显微镜(Olympus Cooperation,Tokyo,Japan，BX53F)进行病理学观察并拍片。每张切片随机抽取5个高倍视野(×40)，每组8个前列腺切片，共40个视野，用IPP(Image-Pro Plus,IPP)图像统计软件(Media Cybernetics,Silver Spring,MD,USA,version 6.0)统计腺腔面积和上皮高度〔9〕。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件(IBM COMPANY,USA)行独立样本t检验。

2 结 果

2.1小鼠体重和前列腺系数变化 小鼠的初始体重(16.16±0.90)g，第9周时，Dio组有60% 即12只小鼠达到肥胖标准(为Ob组)。Ob组肥胖小鼠与C组小鼠体重分别为(34.16±1.03)g和(25.83±1.06)g，两组之间具有统计学差异(t=-21.195，P<0.05),图1为两组小鼠平均体重曲线图，Ob组小鼠体重增长速度大于C组。两组之间内脏脂肪分别为(2.08±0.27)g和(0.41±0.07)g，具有显著性差异(t=-16.792，P<0.05)。体重、腹腔脂肪重量等是判断肥胖的主要标准，Ob组小鼠体重、内脏脂肪重量与C组相比均有显著差异，从形态学表明达到肥胖标准〔7〕，肥胖率为60%。Ob组与C组前列腺重量分别为(116.38±27.71)mg和(44.38±9.86)mg，两组比较具有统计学差异(t=-6.925，P<0.05)。Ob组与C组前列腺指数分别为(3.44±0.82)和(1.72±0.37)，两组之间具有统计学差异(t=-6.775，P<0.05)。Ob组和C组小鼠前列腺体积分别为(0.12±0.03)ml和(0.03±0.01)ml，两组间具有统计学差异(t=-5.434，P<0.05)。

与C组比较：1)P<0.05图1 肥胖小鼠体重增长曲线图

2.2血糖血脂变化 小鼠经过8 w的高脂喂养后，Ob组和C组小鼠血糖浓度分别为(7.79±0.84)nmol/μl和(6.60±0.94)nmol/μl，具有统计学差异(t=-2.659,P<0.05)。Ob组和C组TG分别为(1.31±0.18)nmol/μl和(1.16±0.24)nmol/μl,血清LDL-C分别为(0.13±0.04)ng/μl和(0.10±0.03)ng/μl，虽然两组之间甘油三酯和低密度脂蛋白水平无明显差异(t=-1.495，-1.396；P=0.157，0.185)，但是Ob组有升高的趋势；Ob组和C组HDL-C分别为(0.43±0.01)ng/μl和(0.36±0.07)ng/μl，差异有统计学意义(t=-2.881，P<0.05)。

2.3前列腺组织病理学变化 在病理学检查中，通过显微镜观察各组中每只小鼠的前列腺组织切片，发现C组小鼠前列腺无增生相关的变化特点。Ob组小鼠前列腺上皮细胞呈柱状、高柱状，腺腔面积增加,腺上皮高度增加。大量乳头状增生突向腺腔内，腺腔内可见分泌物。腺体周围附着大量脂肪组织。同时用IPP图像分析软件统计发现Ob组前列腺腺腔面积(17 629.73±4 966.57)μm2和上皮高度(14.35±4.96)μm,均大于C组腺腔面积(12 447.93±5 600.36)μm2和上皮高度(9.90±2.97)μm，两组具有统计学差异(t=-4.378，-4.866；P=0.000)。见图2。

2.4小鼠雌雄激素变化 Ob组E2水平为(0.049±0.012)ng/ml，高于C组(0.045±0.009)ng/ml(t=-0.550,P>0.05)，Ob组T水平为(1.850±0.505)ng/ml，低于C组(2.043±0.448)ng/ml,虽无统计学差异(t=0.777，P>0.05)，但Ob组E2水平呈上升的趋势，T水平呈下降趋势，且Ob组E2/T比值(0.036±0.008)明显大于C组(0.022±0.010)(t=-2.428，P<0.05)。

图2 小鼠前列腺组织HE染色结果(×200)

3 讨 论

高脂饲料诱导肥胖的方法是肥胖相关研究中应用的最广的建模方法，其诱导的单纯性肥胖模型与人类的单纯性肥胖相似性很高〔10〕。近年研究发现肥胖引发的代谢综合征可能是引发BPH的主要因素之一〔11～13〕。一定程度的新陈代谢紊乱会驱使BPH的病理变化，越来越多的证据阐明增加的脂肪，血糖紊乱，高密度脂蛋白胆固醇，以及低密度脂蛋白胆固醇与BPH具有密切联系〔2,3〕。研究者将肥胖、糖尿病、高脂血症、高血压等与前列腺增生合并于代谢综合征〔14〕。并且已有研究成功造模高脂血症合并前列腺增生大鼠模型，以及糖尿病合并前列腺增生大鼠模型〔15,16〕。肥胖是代谢综合征发病的病理生理学基础〔17〕。肥胖，特别是BMI≥35 kg/m2的肥胖患者与前列腺增生关联更高〔3〕。实验对小鼠进行8 w的高脂饲料喂养后，小鼠的体重及内脏脂肪重量的增加从形态学表明达到肥胖标准〔8〕。肥胖组糖脂水平具有上升的趋势，与一些流行病调查研究相吻合。前列腺组织重量和体积增大，并呈现出增生变化，导致肥胖小鼠发生前列腺增生病理变化。

肥胖是由于体内脂肪过度堆积并引发以糖脂代谢紊乱为主的代谢性疾病，随着时间的延长和脂肪堆积加剧，进一步引发很多其他疾病〔18〕。肥胖可导致血糖升高，降低高密度脂蛋白水平，增加低密度脂蛋白水平以及胆固醇水平等脂代谢紊乱变化，而长期的糖脂代谢紊乱会增加前列腺增生的风险〔19〕。血糖增高易累及微小血管损伤，改变局部微循环，以及通过诱导雄激素高表达、生长因子表达刺激前列腺上皮细胞和间质细胞增生〔20,21〕，血糖浓度是前列腺增大的风险因子〔5〕。基础研究发现高脂喂养的高血脂大鼠出现低密度脂蛋白增高，前列腺增大和膀胱过度活动以及勃起功能障碍，阐明新陈代谢与BPH的生理上联系〔15〕。Vignozzi等〔22〕发现高脂喂养动物具有性腺机能衰退和新陈代谢紊乱相关的特点。高脂饮食影响前列腺病理变化，如腺体的炎症状态和肌纤维化、组织缺氧〔23〕。

性激素紊乱是导致前列腺增生的主导因素已被大量研究证实。前列腺的生长依赖于雌、雄激素的协同作用,雌、雄激素的比例失衡是前列腺增生发生和进展的原因之一〔24〕。E2/T的比值增高有可能是模型小鼠BPH发生的又一机制，肥胖也可能通过对性激素水平的影响而加速前列腺组织的增生。Tindall等〔25〕报道肥胖影响多种激素的代谢,其中包括雄性激素在脂肪组织中经芳香化转变成雌性激素。Gat等〔26〕提出肥胖者腹内压比较高，影响前列腺组织静水压高，会阻碍前列腺与睾丸的静脉回流，从而导致睾丸内睾酮浓度增加，前列腺睾酮浓度减少，进而促使前列腺增生发生。

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〔2017-02-15修回〕

(编辑 徐 杰)

R3

A

1005-9202(2017)19-4700-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.005

国家自然科学基金资助项目(81472148)；上海市体育局科技综合计划项目(Z022)

刘向云(1976-)，女，副教授，博士，硕士生导师，主要从事运动医学研究。

向玖琳(1990-)，女，硕士，主要从事运动医学研究。