高饱和脂肪饮食对老年大鼠学习记忆和脑Aβ生成的影响及机制

张 煜 孟冬丽 杨 磊 张 伟 卜勇军 吴 辉 石如玲

(新乡医学院生物化学与分子生物学教研室，河南 新乡 453003)

高饱和脂肪饮食对老年大鼠学习记忆和脑Aβ生成的影响及机制

张 煜 孟冬丽 杨 磊1张 伟 卜勇军2吴 辉2石如玲2

(新乡医学院生物化学与分子生物学教研室，河南 新乡 453003)

目的观察高饱和脂肪饮食对老年大鼠学习记忆和脑β-淀粉样蛋白(Aβ)生成的影响及机制。方法26只雄性老年大鼠随机分为对照组和高饱和脂肪组各13只，对照组大鼠给予正常饲料，高饱和脂肪组大鼠给予含15%牛油饲料，喂养3个月。用Morris水迷宫测定大鼠学习记忆能力，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定海马Aβ含量，用免疫组织化学染色检测脑内β-淀粉样前体蛋白(APP)表达，用黄嘌呤氧化酶法测定血清及脑组织总超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果与对照组相比，高饱和脂肪组大鼠平均逃避潜伏期明显延长(P<0.05)，穿越原平台所在位置次数显著减少(P<0.01)，脑皮质和海马区APP蛋白表达明显增多(P<0.01，P<0.05)，海马Aβ含量显著升高(P<0.01)，血清及脑组织总SOD水平均显著降低(P<0.01，P<0.05)。结论高饱和脂肪饮食降低学习记忆能力、增加APP和Aβ水平，其机制可能与降低脑抗氧化能力有关。

高饱和脂肪；学习记忆；β-淀粉样蛋白；氧化应激；阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(AD)病因至今不明。β-淀粉样蛋白(Aβ)是AD老年斑的主要成分，来自于β-淀粉样前体蛋白(APP)的裂解，Aβ的过度产生和聚集是AD发生发展的关键环节。食物脂肪类型与大脑认知功能及AD发生相关，摄入过多饱和脂肪使AD发生率升高，而补充多不饱和脂肪则保护认知功能，降低AD的发生〔1～3〕。动物实验也发现食物中增加饱和脂肪及胆固醇损害大鼠认知能力〔4,5〕。本实验观察高饱和脂肪饮食对大鼠学习记忆能力和脑Aβ生成的影响及机制。

1 材料与方法

1.1动物分组及取材 将雄性老年SD大鼠20月龄，华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，分为对照组和高饱和脂肪组，每组13只。对照组大鼠给予普通饲料，高饱和脂肪组给予高饱和脂肪饲料(普通饲料+15%牛油)，喂养3个月。Morris水迷宫实验结束1 w后，每组各取3只大鼠，麻醉后4%多聚甲醛全身灌流固定，取脑用于APP免疫组化染色。其余大鼠禁食一夜，麻醉后股动脉放血处死。取血分离血清-20℃保存，用于测定血清总超氧化物歧化酶(SOD)活性。迅速剥脑，分离海马和大脑皮质置于液氮中，然后-80℃保存，用于测定Aβ和总SOD。

1.2试剂与仪器 主要试剂：Aβ酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(Cusabio公司)、APP单克隆抗体6E10(英国Abcam公司)、二抗和免疫组织化学染色试剂盒(北京中杉金桥生物公司)、SOD测定试剂盒、考马斯亮蓝试剂盒(南京建成生物工程研究所)；主要仪器：Morris水迷宫(上海移数信息科技有限公司)、全自动酶标仪(Thermo公司)、分光光度计(UNICO公司)、光学显微镜(日本Olympus)、形态学图像分析系统(江苏捷达)。

1.3Morris水迷宫测试大鼠学习记忆能力 正式实验前1 d让大鼠自由游泳2 min熟悉水迷宫环境。采用定位航行实验测量学习能力，历时4 d。每天训练3次，每次训练间隔4 min，每次训练随机选择一个入水点。将大鼠面向池壁放入水池，同一次训练所有大鼠入水点相同。记录2 min内找到水下平台所需的时间，即逃避潜伏期。如果大鼠在120 s内未找到平台，将其引至平台，这时潜伏期计为120 s。将3次训练的逃避潜伏期取平均值，反映大鼠的学习能力。定位航行实验结束后，第5天撤除水下平台，进行空间探索实验测定记忆能力。在同一入水点将大鼠放入水中，记录其120 s内穿越原平台位置的次数。

1.4APP免疫组织化学染色及图像分析 将固定后的脑组织脱水、包埋、切片(厚度5 μm)等处理，石蜡切片脱蜡至水后，过氧化物酶封闭，用甲酸修复抗原，采用SP法染色，鼠抗APP抗体1∶50稀释。显微镜下观察大脑皮质和海马APP阳性反应细胞的形态和数目，阳性反应细胞的胞膜和胞质呈棕黄色。400倍光镜下扫描海马和皮质图像，用视野内阳性细胞的平均光密度值表示海马或皮质APP的蛋白表达量。

1.5ELISA测定海马Aβ40的含量 称取100 mg海马组织加入1 ml冷磷酸盐缓冲液(PBS)冰浴电动匀浆，匀浆液反复冻融2次后，4℃离心，8 000 r/min，10 min，取上清用于Aβ40含量检测。

1.6血清及脑皮质总SOD活性的测定 用黄嘌呤氧化酶法测定总SOD活性。待测脑皮质加生理盐水制备成10%的组织匀浆，4℃离心，3 000 r/min，10 min，上清用于总SOD活性测定及蛋白定量；血清直接用于总SOD活性测定。SOD活性测定方法按照试剂盒说明书进行。

1.7统计学方法 采用t检验。

2 结 果

2.1大鼠学习记忆能力 定位航行试验中，高饱和脂肪组平均逃避潜伏期〔(51.31±12.70)s〕较对照组显著延长〔(42.65±9.63)s，P<0.05〕，表明高饱和脂肪饮食使大鼠学习能力下降。空间探索试验中，饱和脂肪组穿越原平台所在位置的次数〔(4.27±1.16)次〕较对照组显著减少〔(5.83±1.26)次，P<0.01〕，表明高饱和脂肪饮食使大鼠记忆能力降低。

2.2皮质和海马区APP免疫组织化学染色 APP阳性反应物为棕黄色，分布于细胞膜及胞质，细胞核不显色。与对照组相比，高饱和脂肪组皮质(0.269±0.029)和海马各区(0.127±0.010)阳性细胞数量增多，着色增强较对照组显著增高(0.185±0.014，0.105±0.008，P<0.05，P<0.01)。见图1。

图1 各组皮质和海马APP表达(DAB，×400)

2.3海马Aβ40含量 高饱和脂肪组海马Aβ40含量〔(2.77±0.44)pg/mg〕较对照组〔(1.84±0.62)pg/mg〕显著增高，是对照组的1.5倍(P<0.01)。

2.4血清及脑组织总SOD活性 与对照组血清〔(92.42±4.72)×103U/L〕和脑组织总SOD〔(148.42±13.91)×103U/g〕活性相比，高饱和脂肪组血清〔(82.47±9.47)×103U/L〕及脑组织总SOD活性〔(132.18±11.6)×103U/g〕均显著降低(P<0.01，P<0.05)。

3 讨 论

研究表明高饱和脂肪饮食损害学习记忆能力、增加AD发生率〔5,6〕。本研究表明高饱和脂肪饮食对学习记忆能力具有损害作用。Aβ是各种原因诱发AD的关键因子，在启动AD的病理级联反应中发挥关键作用。本研究发现高饱和脂肪饮食大鼠不仅脑内APP表达增多，海马Aβ40水平也升高，从整体水平上证明高饱和脂肪饮食促进APP表达和Aβ生成，这可能是高饱和脂肪饮食增加AD的机制之一。研究表明氧化应激可增加APP、β分泌酶表达，促进Aβ生成〔7〕；Aβ增多又通过增强氧化应激进一步促进Aβ产生，形成恶性循环〔8〕。SOD是机体抗氧化体系的重要酶之一，其活力的高低反映机体清除氧自由基的能力。研究表明高脂饮食增强氧化应激〔9〕，降低SOD活性〔10〕。本研究也发现高饱和脂肪饮食大鼠血清及脑组织抗氧化酶SOD总活性降低，推测高饱和脂肪饮食降低学习记忆能力、促进Aβ生成的机制可能与脑抗氧化能力降低有关。

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4Granholm AC,Bimonte-Nelson HA,Moore AB,etal.Effects of a saturated fat and high cholesterol diet on memory and hippocampal morphology in the middle-aged rat〔J〕.J Alzheimers Dis,2008;14(2):133-45.

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9Noeman SA,Hamooda HE,Baalash AA.Biochemical study of oxidative stress markers in the liver,kidney and heart of high fat diet induced obesity in rats〔J〕.Diabetol Metab Syndr,2011;3(1):17.

10Ozay R,Uzar E,Aktas A,etal.The role of oxidative stress and inflammatory response in high-fat diet induced peripheral neuropathy〔J〕.J Chem Neuroanat,2014;55:51-7.

〔2016-09-06修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

Effectofhigh-saturated-fatdietonlearningandmemoryandAβgenerationofagedratbrainanditsmechanism

ZHANGYu，MENGDong-Li，YANGLei，etal.

DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology，XinxiangMedicalUniversity，Xinxiang453003，Henan，China

ObjectiveTo explore the effects of high-saturated-fat diet on learning and memory and Aβ generation of rat brain and investigate its mechanism.MethodsTwenty six males aged rats were randomly divided into control and high-saturated-fat groups (n=13 each). The control group was given a normal diet, and the high-saturated-fat group was given high-saturated-fat diet containing 15% beef tallow for three months. The spatial learning and memory abilities were examined by Morris water maze test. Aβ40 content in hippocampal was measured by ELISA. β-amyloid-precursor protein (APP) expression was measured by immunohistochemistry staining. Serum and brain total superoxide dismutase (SOD) activities were measured by detecting xanthine oxidase activity.ResultsCompared with the control group, the average escape latency prolonged and platform crossing number were decreased in the high-fat group. Cerebral cortex and hippocampus APP protein expression and hippocampal Aβ40 content were increased significantly in the high-fat group. Total SOD activities in serum and brain tissue in the high-fat group were significantly lower than those of control group.ConclusionsHigh-saturated-fat diet might reduce the ability of learning and memory and promote Aβ generation, and its mechanism might be related to decreasing antioxidant capacity of brain.

Saturated fat; Learning and memory; β-amyloid; Oxidative stress; Alzheimer′s disease

Q547;R741

A

1005-9202(2017)19-4705-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.007

国家自然科学基金资助项目(No.81500984)；河南省重点科技攻关项目(No.152102310112)

1 新乡医学院护理学院 2 新乡医学院公共卫生学院

石如玲(1970-)，女，教授，硕士生导师，主要从事脂类代谢与老年痴呆发病机制研究。

张 煜(1977-)，男，讲师，主要从事老年痴呆发病机制研究。