DHPG对食管鳞癌细胞KYSE-450增殖的作用

陈彦民 赵宝生 冯 杰 谷城威 刘玉珍

(新乡医学院第一附属医院，河南 卫辉 453100)

DHPG对食管鳞癌细胞KYSE-450增殖的作用

陈彦民 赵宝生 冯 杰 谷城威 刘玉珍

(新乡医学院第一附属医院，河南 卫辉 453100)

目的探讨Ⅰ组代谢型谷氨酸受体激动剂3，5二羟基苯甘氨酸(DHPG)对食管鳞癌细胞KYSE-450增殖的影响及其可能的机制。方法体外常规培养KYSE-450，采用Western印迹检测Ⅰ组代谢型谷氨酸受体在食管鳞癌细胞的表达情况，应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同浓度DHPG对KYSE-450细胞增殖的影响，通过Western印迹检测药物作用后KYSE-450细胞中AKT、mTOR、4EBP1蛋白及其磷酸化水平的变化。结果mGluR1和mGluR5在KYSE-450中均有表达。50、100、150 μmol/L DHPG对KYSE-450细胞增殖均有抑制作用，且呈剂量和时间依赖性。空白对照组细胞胞质透亮，折光性强，细胞呈梭形、不规则星形。100 μmol/L DHPG加药组细胞形态随药物浓度增加及作用时间的延长出现皱缩，细胞核固缩成点状，有时出现空泡状。与对照组相比，100 μmol/L DHPG加药72 h后，p-AKT、p-mTOR、p-4EBP1水平均明显降低。结论Ⅰ组代谢型谷氨酸受体激动剂DHPG能够抑制KYSE-450的增殖，其机制可能与抑制AKT/mTOR信号通路相关。

食管鳞癌；Ⅰ组代谢型谷氨酸受体；DHPG、细胞增殖

根据病理类型，食管癌主要分为鳞状细胞癌和腺癌，前者发病率在我国占95%以上。早期食管癌症状轻微，临床就诊时多数患者已处于中晚期〔1〕，因此丧失外科手术治疗的机会，从而需要抗肿瘤药物治疗。谷氨酸是中枢神经系统最重要兴奋性神经递质，通过激活谷氨酸受体发挥作用。谷氨酸受体分离子型和代谢型两类。离子型受体通过对细胞膜Na+、Ca2+等离子通透性的改变而发挥生物学效应，分为NMDA、AMPA 及KA受体三类。代谢型谷氨酸受体(mGluR)属于G蛋白耦联受体(GPCR)。目前mGluR有8种亚型，分别命名mGluR1 ～ mGluR8。根据其氨基酸序列的同源性、信号转导机制及药理学特性，mGluRs被分成Ⅲ组：第Ⅰ组包括mGluR1和mGluR5；第Ⅱ组包括mGluR2和mGluR3；第Ⅲ组包括mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8〔2〕。虽然谷氨酸受体主要在中枢神经系统发挥作用，但是越来越多的证据表明，谷氨酸受体亦存在于外周组织中，并且与肿瘤的增殖、转移具有密切关系〔3〕。研究发现，mGluRs调控黑色素瘤〔4〕、神经胶质瘤〔5〕、肺癌〔6〕、口腔鳞癌〔7〕、肝癌〔8〕、乳腺癌〔9〕的生长与转移，由此说明谷氨酸及其受体在肿瘤生长过程中发挥着重要的调节作用。目前mGluRs在食管癌生长中的作用尚未见报道，本研究主要探讨Ⅰ组代谢型谷氨酸受体mGluR1、mGluR5的激动剂DHPG对食管鳞癌细胞KYSE-450增殖的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂 食管癌细胞KYSE-450、正常食管细胞Het-1A购于上海吉凯基因化学技术有限公司，胎牛血清购自Clark，RPMI1640购自Corning，DHPG购自Abcam。单克隆兔抗mGluR1、mGluR5购自Abcam，单克隆兔抗AKT、p-AKT(Ser473)、mTOR、p-mTOR (Ser2448)、p-4EBP1(Thr37/46)购自CST公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2细胞培养 将KYSE-450接种在装有适量RPIM1640/F12培养液(含体积分数5%FBS 和体积分数1%青链霉素)的培养皿中，置于37℃、含体积分数5% CO2饱和湿度培养箱内培养，每3天传代一次，细胞呈单层贴壁生长。

1.3不同浓度DHPG对KYSE-450细胞增殖的影响 取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化成单个悬浮细胞后以每孔4 000个接种于96孔板中每孔加入100 μl的培养基。待细胞24 h贴壁生长后，按每个浓度设置5个复孔，分为空白对照组和DHPG加药组使其终浓度分别为(50、100、150 μmol/L)。继续培养24、48、72 h后每孔分别加入5 g/L的MTT 10 μl，37℃继续孵育4 h后弃上清，加入100 μl DMSO，混匀震荡，于酶标仪490 nm波长处测定吸光度(A)值，计算药物对细胞增殖的抑制率。增殖抑制率=(A空白对照组-A实验组)/A实验组×100%。

1.4Western印迹检测 mGluR1、mGluR5、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-4EBP1蛋白水平 收集空白对照组与DHPG 100 μmol/L组处理72 h后KYE-450细胞总蛋白，用于mGluR1、mGluR5、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-4EBP1的检测。二喹淋甲酸(BCA)检测法进行蛋白定量，取蛋白样品30 μg，电泳后转膜，5% 的脱脂奶粉封闭1 h，AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-4EBP1抗体用 5%BSA稀释(1∶100)，4℃过夜，TBST 洗膜(3次×10 min)，5%的牛奶稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶8 000)，TBS洗膜，按照ECL说明书1∶1配置发光工作液，凝胶成像仪成像。

1.5统计学处理 用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1Western印迹检测mGluR1、mGluR5在食管癌细胞系中均有表达 mGluR1、mGluR5在正常食管细胞系Het-1A 和食管鳞癌细胞系KYSE-450中均有表达。见图1。

图1 mGluR1、mGluR5在正常食管细胞系及食管鳞癌细胞系中均有表达

2.2DHPG对细胞增殖的影响结果 10、50、100、150 μmol/L DHPG处理KYSE-450细胞24、48、72 h后，KYSE-450增殖抑制率随药物浓度的增加和作用时间的延长而增高，且呈现剂量和时间的依赖性(P<0.05)。见表1。

表1 不同浓度DHPG对KYSE-450增殖的抑制率

与空白对照比较：1)P<0.05；与50 μmol/L DHPG组比较：2)P<0.05；与100 μmol/L DHPG组比较：3)P<0.05；与24 h比较：4)P<0.05；与48 h比较：5)P<0.05

2.3DHPG对细胞形态学影响 结果见图2，空白对照组KYSE-450胞质透亮，折光性强，细胞呈现出不规则星型或多角形。100 μmol/L DHPG处理KYS-E450细胞后，随着时间的延长细胞逐渐皱缩，细胞核缩成点状。

A:空白对照组；B：100 μmol/L DHPG组；标尺：100 μm图2 DHPG处理KYSE-450 24、48、72 h后细胞形态学变化

2.4Western印迹检测AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-4EBP1蛋白水平 选取加药浓度0、100 μmol/L DHPG加药72 h后，以GAPDH为内参检测AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、p-4EBP1蛋白变化情况。结果显示p-AKT、p-mTOR、p-4EBP1表达水平明显下降。见图3。

图3 DHPG处理后各蛋白变化情况

3 讨 论

近年我国食管癌的发病率和死亡率呈现明显的上升趋势，5年生存率仅为19.9%〔1〕，寻找新的食管癌治疗途径是目前食管癌研究中的重要领域。谷氨酸受体不仅存在于神经系统，也存在于外周非神经系统，包括正常组织和肿瘤组织〔2〕。文献报道给予NMDA受体阻断剂及AMPA受体阻断剂分别抑制胰腺癌细胞、白血病细胞体外增殖〔10〕，给予mGluR1、mGluR5代谢型谷氨酸受体阻断剂抑制神经胶质瘤〔5〕、肝癌〔8〕、口腔鳞癌〔7〕和小细胞肺癌〔11〕的增殖，上述结果表明NMDA、AMPA、mGluR1、mGluR5参与促进肿瘤的生长。然而，Iacovelli及其同事报道〔12〕，激活Ⅲ组代谢型谷氨酸受体mGluR4抑制髓母细胞瘤增殖，表明mGluR4参与肿瘤的生长抑制。这些研究结果提示谷氨酸受体在肿瘤的发生、发展过程中具有重要的调节作用，不同受体亚型对肿瘤发生、发展的作用可能具有组织特异性。

本研究结果推测Ⅰ组代谢型谷氨酸受体的表达可能参与食管癌的发生、发展。本实验研究结果显示DHPG以剂量和时间依赖性方式抑制KYSE-450细胞增殖。代谢型谷氨酸受体属于GPCR，文献报道mGluRs可以激活AKT/mTOR信号通路发挥生物学功能〔13〕；AKT/mTOR信号通路在恶性肿瘤的进展过程中具有过度激活的现象，而真核翻译起始因子(4EBP1)是mTOR信号通路中重要的下游底物之一〔14〕。有研究显示4EBP1在乳腺癌〔15〕、前列腺癌〔16〕中高表达与其预后不良相关联。本研究结果说明，DHPG对食管癌KYSE-450的增殖抑制作用可能与降低AKT/mTOR信号通路相关。Ⅰ组代谢型谷氨酸受体激动剂DHPG未来可能成为治疗食管癌的一种新型药物，具有潜在的临床应用价值。

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〔2016-12-19修回〕

(编辑 李相军)

TheeffectofDHPGonproliferationofesophagealsquamouscellcarcinomacelllineKYSE-450

CHENYan-Min,ZHAOBao-Sheng,FENGJie,etal.

FirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Weihui453100,Henan,China

ObjectiveTo study the effect of DHPG on the proliferation of esophageal squamous carcinoma KYSE-450 cell line and the possible mechanisms.MethodsKYSE-450 cells were cultured and MTT assay was performed to investigate the effect of DHPG on the proliferation of KYSE-450 cells. Western blot was utilized to detect the protein expression of group Ⅰmetabotropic glutamate receptors both in Het-1A cells derived from normal esophageal epithelia tissue and KYSE-450 cells derived from ESCC tissue. The alteration of phosphorylation of AKT, mTOR as well as 4EBP1 induced by DHPG treatment was examined by Western blot.ResultsBoth mGluR1 and mGluR5 were expressed in KYSE-450 cells. Application of DHPG obviously repressed KYSE-450 cell proliferation in a dose and time dependent manner. Phase contrast imaging showed that untreated control KYSE-450 cells were epithelial-like adherent cells, with a flat and polygonal shape. When treated with 100μmol/L DHPG, the cells gradually appeared to shrink and nuclei were progressively condensed into spots, and sometimes vacuolated, following the duration of drug treatment.When compared with the control group, the protein levels of p-AKT, p-mTOR and p-4EBP1 were significantly decreased at 72 h after 100 μmol/L DHPG administration.ConclusionsDHPG could inhibit KYSE-450 cell proliferation and the mechanism might be related to AKT/mTOR signaling pathway.

Esophageal squamous cell carcinoma; Group I metabotropic glutamate receptor; DHPG; Cell proliferation

R735.1

A

1005-9202(2017)19-4714-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.011

国家自然科学基金(81470271); 河南省科技厅科技攻关计划项目(152102310110)；新乡市重点科技攻关计划项目(ZG15018)

刘玉珍(1964-)，女，教授，主要从事肿瘤转移研究。

陈彦民(1990-)，男，硕士，主要从事食管癌转移机制研究。