重楼总皂甙对小鼠哮喘模型气道炎症的影响及机制

谭莉明 向明均 米长忠 李中正 田紫华 向 波 周卫华

(吉首大学医学院，湖南 吉首 416000)

重楼总皂甙对小鼠哮喘模型气道炎症的影响及机制

谭莉明 向明均 米长忠 李中正 田紫华 向 波1周卫华

(吉首大学医学院，湖南 吉首 416000)

目的探讨重楼总皂甙对小鼠哮喘模型的保护作用及可能机制。方法将24只BALB/c小鼠随机分为空白对照组，模型组，重楼总皂甙低剂量组(LRTPS)和重楼总皂甙高剂量组(HRTPS)，每组6只。除空白对照组小鼠外，其余各组采用卵蛋白致敏建立支气管哮喘小鼠模型，治疗组在造模的同时灌胃给予不同剂量的重楼总皂甙治疗。通过肺组织病理切片、酶联免疫反应(ELISA)法检测肺泡灌洗液中的白细胞介素(IL)-4和干扰素(IFN)-γ水平，Q-PCR 检测肺组织IL-4和IFN-γ mRNA表达水平。结果空白对照组小鼠肺组织支气管无炎性细胞浸润，气道无明显黏液分泌，模型组支气管和血管周围炎性细胞浸润明显，黏膜及黏膜下层水肿明显。治疗组支气管和血管周围炎性细胞浸润明显减少，肺泡结构清晰，肺泡腔和支气管腔无渗出物。哮喘组小鼠的肺泡灌洗液IL-4水平和肺组织IL-4 mRNA表达显著高于对照组；治疗组显著低于哮喘组(P<0.05)。哮喘组小鼠的肺泡灌洗液IFN-γ水平和肺组织IFN-γ mRNA表达显著低于对照组，治疗组显著高于哮喘组(P<0.05)。结论重楼总皂甙能明显减轻哮喘气道炎性反应，其机制可能与恢复局部Th1 / Th2细胞因子平衡有关。

哮喘；重楼总皂甙；白细胞介素(IL)-4；干扰素(IFN)-γ

中医药防治哮喘有一定的优势，寻求有效的防治哮喘的中医药是当前的研究热点。重楼是百合科植物重楼(paris polyphylla smith)的干燥根茎,主要产于云南、贵州、重庆和湖南武陵山区等地。重楼具有抗肿瘤、抑菌、抗病毒、止咳平喘和免疫调节等多种药理作用〔1～3〕。重楼皂甙是重楼的主要有效成分具有抗炎作用，但重楼皂甙是否具有抗炎平喘的作用未见报道。本文拟研究重楼总皂甙对小鼠哮喘模型的保护作用，为临床治疗支气管哮喘提供实验依据。

1 材料与方法

1.1药物 重楼总皂甙购自成都曼思特生物科技有限公司。

1.2实验动物 雌性BALB/c小鼠24 只，体重(20±2)g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。饲养于标准环境，12 h光照周期。

1.3试剂 卵清蛋白(OVA)、氢氧化铝粉，来自美国Sigma公司，TRIzol试剂、逆转录试剂盒和SYBR Green Mix试剂盒均购自唯赞生物科技有限公司，白细胞介素(IL)-4和干扰素(IFN)-γ试剂盒来自武汉博士德生物有限公司；其他试剂为分析纯，来自上海生工生物有限公司。

1.4动物分组及给药 小鼠随机分为空白对照组(NC组)，模型组(OVA组)，重楼总皂甙低剂量组(LRTPS)和重楼总皂甙高剂量组(HRTPS)。除NC组外，其他各组小鼠在第1、14天开始致敏，即腹腔注射致敏混合液200 μl /只(50 g OVA，10% Al(OH)3，pH6.5)。在致敏后的第21～27天给予雾化吸入5% OVA 5 ml。进行腹腔注射和雾化吸入时，NC组以0.9% NaCl代替OVA。治疗组于致敏后第14～27天分别给予相应剂量的药物灌胃，灌胃1 h后予雾化吸入。LRTPS组及HRTPS组分别给予重楼总皂甙2.5 mg/kg和10 mg/kg进行灌胃，NC组和DVA组分别给予同等量的生理盐水灌胃。

1.5ELISA法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)IL-4和IFN-γ 处死小鼠后，每只小鼠留取左肺组织进行组织病理学观察，右肺进行支气管肺泡灌洗。支气管肺泡灌洗：切开气管，插管，用pH7.4的PBS灌洗3次，回收灌洗液即为BALF。离心后取上清，按小鼠细胞因子检测试剂盒说明书操作，检测IL-4和IFN-γ水平。

1.6实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测肺组织IL-4和IFN-γ mRNA表达水平 用TRIzol试剂提取肺组织RNA，采用Nandrop核酸蛋白定量仪检测RNA浓度，根据试剂盒说明书逆转录合成cDNA, 2×SYBR Green Mix进行实时定量PCR检测肺组织中IL-4和IFN-γ的表达水平，扩增条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火20 s，72℃延长20 s，设置40个循环，所得实验数据采用2-ΔΔCt方法计算。Q-PCR引物序列，GAPDH前向：AATGGATTTGGACGCATTGGT，反向TTTGCACTGGTACGTGTTGAT；IL-4前向：CCCCAGCTAGTTGTCATCCTG，反向CAAGTGATTTTTGTCGCATCCG；IFN-γ前向：ATGAACGCTACACACTGCATC，反向CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC。引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。

1.7肺组织病理切片 末次激发24 h后处死小鼠，支气管肺泡灌洗和肺灌注后，用1 ml冰上冷却过的PLP 固定剂(0.01 mmol/L sodium mperiodat, 0.075 mol/L lysine, 1% paraformaldehyde)注入肺内，用手术缝合线系住气管，取下完整的肺并放进PLP固定液中4℃过夜。24 h后，用蒸馏水冲洗并保存于70%酒精中。石蜡包埋后，切片、HE染色，光镜下观察肺组织病理学变化。

1.8统计学分析 采用SPSS16.0软件，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法。

2 结 果

2.1各组小鼠肺组织病理变化 NC组小鼠肺组织支气管无炎性细胞浸润，气道无明显黏液分泌；OVA组支气管和血管周围炎性细胞浸润明显(主要为嗜酸性粒细胞、中性粒细胞浸润)，黏膜及黏膜下层水肿明显，气道腔中可见较多的黏液和黏液栓。LRTPS组和HRTPS组小鼠肺组织支气管和血管周围炎性细胞浸润明显减少，肺泡结构清晰，肺泡腔和支气管腔无渗出物，与OVA组比较差异明显。见图1。

图1 小鼠肺组织切片

2.2各组小鼠BALF中IL-4和IFN-γ表达水平 OVA组BALF中IL-4水平〔(84.6±9.76)mg/ml〕较NC组〔(18.9±2.84)ng/ml〕显著升高，IFN-γ水平显著降低〔(96.5±13.58)pg/ml vs (324.8±36.48)pg/ml〕(P<0.05)。经重楼总皂甙治疗后，BALF中IL-4的水平〔LRTPs组(42.5±5.62)mg/ml,HRTPS组(34.7±4.86)mg/ml〕与OVA组比较明显下降，IFN-γ水平〔(156.8±19.76)pg/ml,(242.3±21.57)pg/ml〕明显回升(P<0.05)。

2.3各组小鼠肺组织中IL-4和IFN-γ mRNA表达水平 OVA组肺组织IL-4 mRNA(4.8±0.76)表达较NC组(1)显著升高，IFN-γ mRNA表达(0.34±0.08)显著降低(P<0.05)。经重楼总皂甙治疗后，肺组织IL-4 mRNA的表达(LRTPS组：2.3±0.36，HRTPS组：1.9±0.23)与OVA组相比明显下降，IFN-γ mRNA表达(LRTPS组：0.76±0.13，HRTPS组：0.84±0.15)明显回升(P<0.05)。

3 讨 论

本研究结果显示，灌胃给予重楼总皂甙能显著减轻肺组织炎症，降低肺组织和肺泡中的IL-4水平，明显升高肺组织和肺泡中的IFN-γ水平。IL-4是重要的Th2型关键细胞因子，在人类过敏性哮喘的发生发展中发挥重要作用〔4〕。IL-4促进Th2型T细胞的分化和增殖，促进B细胞产生IgG1和IgE〔5, 6〕；在过敏小鼠中，IL-4单克隆抗体能显著降低IgE水平和气道嗜酸性粒细胞增多〔7〕。这些Th2细胞因子，与Th1产生的IFN-γ相反，能促进细胞增强IgG2a的产生，抑制抗原诱导的AHR、IgE产生和抗原诱导的嗜酸性粒细胞募集，从而抑制哮喘样表型〔8〕。本研究清楚地证明了口服重楼总皂甙可剂量依赖性抑制Th2产生细胞因子IL-4，并恢复降低的Th1细胞因子IFN-γ，恢复局部Th1/Th2细胞因子平衡，可以解释重楼皂甙能减少气道炎症和细胞浸润以及减少总IgE水平。因此，局部Th1/Th2细胞因子平衡的恢复是开发过敏性哮喘新疗法的合理策略。

1滕文静,周 超,曹晓靖,等.重楼皂苷影响JAK/STAT3通路诱导结直肠癌细胞凋亡〔J〕.时珍国医国药,2015；26(4):808-11.

2周满红,于 红,贺华经,等.重楼总皂苷对热灭活大肠杆菌诱导大鼠腹腔巨噬细胞分泌TNFα-及IL-1β的影响〔J〕.四川中医,2008；26(4): 24-6.

3周满红,杜文胜,龙胜双,等.重楼总皂苷对脂多糖诱导大鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α及IL-1β的影响〔J〕.四川中医,2008；26(3): 14-6.

4Cohn L,Elias JA,Chupp GL.Asthma:mechanisms of disease persistence and progression〔J〕.Annu Rev Immunol,2004;22:789-815.

5Blaeser F,Bryce PJ,Ho N,etal.Targeted inactivation of the IL-4 receptor alpha chain I4R motif promotes allergic airway inflammation〔J〕.J Exp Med,2003;198(8):1189-200.

6Corry DB.Emerging immune targets for the therapy of allergic asthma〔J〕.Nat Rev Drug Discov,2002;1(1):55-64.

7Renz H,Enssle K,Lauffer L,etal.Inhibition of allergen-induced IgE and IgG1 production by soluble IL-4 receptor〔J〕.Int Arch Allergy Immunol,1995;106(1):46-54.

8Iwamoto I, Nakajima H,Endo H,etal.Interferon gamma regulates antigen-induced eosinophil recruitment into the mouse airways by inhibiting the infiltration of CD4+T cells〔J〕.J Exp Med,1993;177(2):573-6.

〔2017-03-15修回〕

(编辑 李相军)

R562.25

A

1005-9202(2017)19-4703-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.006

国家自然科学基金(No.81560038，81460766)；湖南省教育厅青年项目(No.13B090)；吉首大学大学生创新性项目(JSU-CX-2013-28)；湖南省卫生厅项目(B2014-184)

1 湘西自治州人民医院

周卫华(1978-)，男，副教授，主要从事民族医药的抗肿瘤和免疫调节作用研究。

谭莉明(1981-)，女，讲师，主要从事民族医药的免疫调节药理作用研究。