大鼠肝癌发展过程MAPK信号转导通路蛋白的动态变化

林冬静 徐 冶 田洪燕 赵丽微 李 强 卢晓晶 陈 为

(吉林医药学院组织学与胚胎学教研室，吉林 吉林 132013)

大鼠肝癌发展过程MAPK信号转导通路蛋白的动态变化

林冬静 徐 冶1田洪燕 赵丽微2李 强3卢晓晶4陈 为5

(吉林医药学院组织学与胚胎学教研室，吉林 吉林 132013)

目的研究p38、JNK、ERK表达与肝癌发生的关系。方法雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组和模型组，空白对照组自由饮用食用水；模型组采用间断性自由饮用二乙基亚硝胺(DEN)食用水的方法诱发肝癌模型，第0、5、9、12、14、16、18、20周取出肝脏，观察其病理学改变；检测p38、JNK及ERK1/2 mRNA和蛋白表达情况。结果模型组大鼠肝变硬，出现巨块状结节，癌细胞强嗜碱性，内质网扩张，线粒体肿胀，嵴断裂，核染色质边缘化；与空白对照组比较，模型组p38 mRNA表达水平9、12 w增加(P<0.05)，JNK mRNA表达水平从5 w增加至16 w，随后表达水平显著降低(P<0.05)，ERK mRNA表达水平18 w显著降低(P<0.05)；模型组p-p38蛋白14、16、20 w表达均明显降低(P<0.05)，p-JNK蛋白5 w、12～20 w表达明显升高(P<0.05)，p-ERK1/2蛋白5 w表达明显增加，18 w表达显著降低(P<0.05)。结论DEN诱发大鼠肝癌发生中，MAPK信号中p38、ERK1/2激酶磷酸化水平降低而JNK激酶磷酸化水平增高，可能与内质网和线粒体关系密切。

肝细胞肝癌；二乙基亚硝胺；MAPK；信号转导通路

原发性肝细胞肝癌(HCC)已成为发生率上升最快的恶性肿瘤，这与慢性病毒性肝炎和长期过量饮酒导致肝硬化关系密切〔1,2〕。在大多数已经形成的肿瘤组织中或者经体外实验探讨其成因，发现丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号转导通路发挥重要调控作用。本研究采用二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌模型，模拟人肝细胞癌发生，动态观察该通路不同时相p38、JNK、ERK1/2蛋白表达情况，分析其所代表的三条通路与肝癌发生的关系。

1 材料与方法

1.1实验动物 选用清洁级雄性Wistar大鼠136只，5周龄，体质量140～160 g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供，合格证号：SCXK(吉)2013- 0001。

1.2主要试剂和抗体 Trizol试剂为美国Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒为北京全式金生物技术有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒和增强化学发光(ECL)试剂盒均购自中国碧云天公司。p38、JNK、ERK和GAPDH引物由上海生工合成。p38多克隆抗体和p-p38单克隆抗体分别购自中国凯基生物科技发展有限公司和美国Santa cruz公司，JNK抗体购自美国Abcam公司，p-JNK抗体购自美国Santa cruz公司，ERK1/2和p-ERK1/2多克隆抗体购自中国沈阳万类生物。HRP标记羊抗兔二抗和β-actin抗体购自中国天津三箭公司，其余试剂为国产分析纯。

1.3主要仪器 550型酶标仪和Western电泳槽均为美国Bio-Rad开发公司产品；转膜仪为Tianon公司产品，电泳仪为中国六一仪器厂产品，中国Genesys凝胶成像分析系统采集蛋白表达图像并进行密度分析，D-78532型台式低温超速离心机为日本Hettich公司；JEM-1200EX型透射电镜为日本Hitachi公司产品；凝胶图像分析仪为中国国瑞实验仪器公司产品。

1.4大鼠肝癌模型的建立 适应性饲养7 d，随机分为：①空白对照组(0 w)16 只：饮用灭菌食用水；②模型组120 只：自由饮用灭菌食用水配置0.01%DEN(美国Sigma公司，其纯度为99.9%)溶液，隔天更换1次，连续5 w 后，改饮灭菌食用水3 w，再继续饮用含0.01%DEN溶液12 w 停药。造模过程观察各组大鼠精神状态、体重变化。

1.5取材 诱癌开始后第0、5、9、12、14、16、18、20周分批处死大鼠，空白对照组2只，模型组3只。取出肝脏，观察肝脏外观(大小、色泽、质地、有无结节形成等)，取新鲜肝组织迅速用0.9%生理盐水漂洗，未出现癌灶者取部分肝组织，出现癌灶者取肉眼癌灶及距癌灶边缘1 cm 癌旁组织，均用10%中性甲醛固定，制备石蜡切片；另取一部分组织置于戊二醛和锇酸中双重固定，透射电镜观察肝细胞的超微结构；部分组织于-80℃保存。

1.6HE染色 石蜡切片，经脱蜡、脱水、漂洗、苏木精染色、分化、漂洗、伊红染色、再脱水、透明、封片。光镜下观察，照相。

1.7RT-PCR技术检测基因mRNA表达 按TRIzol试剂盒说明书提取肝组织总RNA，检测总RNA浓度，取RNA样品，按RT-PCR试剂盒说明书操作。PCR产物经1.5%琼脂糖电泳后在凝胶成像系统下观察图像并拍照。目的基因的mRNA相对含量=目的基因密度/GAPDH密度。

1.8Western印迹技术检测蛋白表达 取相同质量的肝组织加入含PMSF的蛋白裂解液，冰上快速组织超声破碎，12 000 r/min离心15 min取上清，采用BCA法测定蛋白浓度。等量等体积的总蛋白经12%分离胶和4%浓缩胶进行SDS-PAGE电泳，电泳后将蛋白转印至PVDF膜。用5%脱脂奶粉摇床缓慢封闭约1.5 h后分别加入适当稀释比例的ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK、p-JNK抗体，4 ℃过夜，第2天加入二抗孵育1 h，PBST漂洗，ECL显影。采用Genesys凝胶成像分析系统采集图像并用图像分析软件对所得条带进行相对定量分析。目的蛋白表达的相对含量=目的蛋白表达密度/β-actin表达密度。

1.9统计学方法 应用SPSS13.0 统计软件进行t检验、方差分析，q检验，秩和检验。

2 结 果

2.1DEN对大鼠一般状态的影响 空白对照组大鼠未出现死亡，精神状态良好，体重增加。模型组大鼠在造模3 w时死亡1只，随着饮用DEN溶液时间延长，大鼠出现嗜睡，精神萎靡，毛色暗，粗糙，不整齐，伴有不洁；9 w后体重有所降低，14 w进食量、进水量均明显减少，尿液发黄，粪便量减少，体重继续下降；18 w时大鼠多聚集蜷曲，很少活动，1例死亡，解剖后见明显肝癌结节，20 w时，懒动体轻，对一般的物理刺激反应极差。

2.2DEN对大鼠肝脏大体形态和病理学改变的影响 见图1～图3。肉眼见空白对照组大鼠肝脏呈现淡红色，具有光泽度，质地柔软而富有弹性，表面光滑，边缘整齐，5、9 w模型组大鼠肝脏颜色略暗，颜色加深，表面光泽度较空白对照组差，12 w时肝表面出现灰白色结节，大小不一，数量不等，散在分布，肝组织边缘钝化，体积略有下降，20 w肝组织变硬，色浅，表面出现巨块状结节，弥漫分布。光镜下可见：空白对照组0 w 大鼠肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，核清晰，大小一致且分布均匀，肝细胞索围绕中央静脉，呈放射状分布，肝窦清晰；模型组大鼠：5 w肝小叶结构基本完整，9 w 部分肝细胞呈气球样变，小叶内可见灶性坏死伴炎性细胞浸润，同时逐渐出现纤维组织增生及肝细胞再生；12～16 w 肝小叶结构破坏，出现纤维组织间隔，形成典型的假小叶结构；18～20 w 癌变期的癌细胞异型性明显，胞核增大，胞质少，嗜碱性增加，可见较多的单核细胞和核分裂相，部分可见癌细胞浸润周围组织，侵犯血管，并有灶内出血、坏死现象。超微结构：空白对照组0 w 大鼠的肝肝细胞内线粒体、高尔基复合体、粗面内质网、滑面内质网和糖原都较为丰富，可见溶酶体，线粒体双层膜和嵴，各时间段的模型组肝细胞的线粒体、高尔基复合体、粗面内质网、滑面内质网、溶酶体、线粒体双层膜等均随着给药时间的增加而出现不同程度的细胞器结构破坏，20 w 时可见内质网扩张，线粒体肿胀，嵴断裂，双层膜结构破坏，部分线粒体形成电子透亮区，核染色质边缘化，部分细胞器外侧可见双侧膜包裹，形成自噬体。

2.3DEN对MAPK通路分子mRNA表达水平的影响 饮用DEN食用水溶液，p38 mRNA表达水平从9 w开始明显升高，直至12 w，在18 w表达水平下降(P<0.05)；JNK RNA表达水平5 w、12 w 增加，14～18 w表达水平降低(P<0.05)。ERK1/2 mRNA表达12 w增加，18 w表达降低(P<0.05)，表明DEN诱发肿瘤发生中p38、JNK、ERK基因mRNA表达均有改变，并且三者间的这种改变不同步，见表1，图4。

2.4DEN对MAPK通路分子蛋白表达水平的影响 与空白对照组比较，0～9 w p-p38蛋白表达升高，至14、16、20 w 降低，18 w时表达升高(P<0.05)；p-JNK蛋白在5～20 w时表达明显升高(P<0.05)；JNK总蛋白表达水平无显著改变(P>0.05)；p-ERK1/2蛋白表达水平5 w升高，18 w 降低(P<0.05)，提示DEN诱发大鼠肝癌发生过程p38和JNK、ERK1/2蛋白发生动态改变，主要在磷酸化水平发挥重要调节作用。见图5，表2。

图1 各组肝脏大体形态变化

图2 各组肝组织病理学改变(HE，× 200)

图3 各组肝细胞超微结构(×6 500)

组别p38JNKERK1/2空白对照组1±0.531±0.491±0.51模型组5w1.49±0.612.05±0.741)0.85±0.0891)模型组9w2.32±0.831)2.65±0.751)1.08±0.21模型组12w2.88±0.91)6.02±1.321)1.40±0.261)模型组14w1.41±0.442.26±0.681)0.94±0.082模型组16w0.75±0.092.54±0.661)1.03±0.19模型组18w1.54±0.641)0.43±0.0761)0.29±0.071)模型组20w1.96±0.581)1.64±0.520

与空白对照组比较：1)P<0.05，下表同

1～8:空白对照组、模型组5、9、12、14、16、18、20 w，下图同图4 各组肝组织p38、JNK、ERK1/2 mRNA表达

图5 各组p38、JNK、ERK1/2磷酸化蛋白表达水平

组别p-p38/p38pJNK/JNKpERK1/ERK1pERK2/ERK2空白对照组1.12±0.511.18±0.461.23±0.380.98±0.25模型组5w1.76±1.051.53±0.361)1.41±0.261)1.35±0.891)模型组9w2.46±1.291.12±0.401.03±0.170.78±0.26模型组12w1.98±0.871.47±0.411)0.95±0.230.48±0.171)模型组14w1.63±0.981)1.34±0.281)0.54±0.461)0.75±0.34模型组16w0.91±1.421)1.59±0.321)0.83±0.080.56±0.0781)模型组18w10.77±4.861)1.45±0.351)0.38±0.0221)0.35±0.0191)模型组20w0.76±0.041)1.45±0.291)1.21±0.530.61±0.23

3 讨 论

信号转导通路MAPK是HCC发展关键通路之一，MAPK信号主要有ERK、JNK、p38-MAPK三条途径，当它们受到EGF、VEGF、PDGF、HGF等生长因子刺激，各个信号分子残余的酪氨酸被磷酸化，活化，进而发挥生物调节功能〔3～7〕。

肝癌动物模型多采用DEN作为诱癌剂〔8〕。DEN是一种DNA羟化物，具有中毒性和致癌性双重效应，有很高的致癌率，特别对于肝脏，最终形成肝硬化伴发HLL。有研究表明DEN诱发HCC时，第1～4周为肝炎、肝纤维化期，为中毒性肝炎表现；第5～12周为肝硬变期；第14～18周为癌变期，这与预后较差的人类HCC特点较为相似〔9〕。本研究显示DEN诱发大鼠HCC发生中，MAPK信号中p38、ERK1/2激酶磷酸化水平降低而JNK激酶磷酸化水平增高，可能与内质网和线粒体关系密切。本研究采用大鼠间断性自由饮用DEN食用水给药途径，模拟人原发性肝细胞肝癌的发生，这样极大减少其他给药途径对大鼠的应激反应，利于后续实验观察和检测。同时结合原发性肝细胞肝癌形成的关键时期(肝炎、肝纤维形成，中毒性肝炎、肝硬变、癌变)进行肝肿瘤组织的定点取材，动态观察MAPK信号转导通路中各种调控因子的变化，补充在已经形成的肿瘤组织中或者是在体外细胞株中得到的结果，为后续开展体外实验MAPK调控肿瘤细胞生物学特征机制时提供依据。

1Schütte K,Bornschein J,Malfertheiner P.Hepatocellular carcinoma-epidemiological trends and risk factors〔J〕.Dig Dis,2009;27(2):80-92.

2Hernandez-Gea V,Toffanin S,Friedman SL,etal.Role of the microenvironment in the pathogenesis and treatment of hepatocellular carcinoma〔J〕.Gastroenterology,2013;144(3):512-27.

3El-Serag HB,Kanwal F,Davila JA,etal.A new laboratory based algorithm to predict development of hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis C and cirrhosis〔J〕.Gastroenterology,2014;146(5):1249-55.

4El-Serag HB,Alsarraj A,Richardson P,etal.Hepatocellular carcinoma screening practices in the department of veterans affairs:findings from a national facility survey〔J〕.Dig Dis Sci,2013;58(11):3117-26.

5毛 华,黄纯炽,赵敏芳.p38MAPK信号传导通路调控VEGF诱导肝癌细胞黏附作用〔J〕.世界华人消化杂志,2006;14(8):778-83.

6周 曙,蔡 涛,覃兴贵,等.JNK信号转导通路在黄芩苷诱导肝癌细胞凋亡中的作用〔J〕.解放军医药杂志,2015;27(4):20-2.

7戴红良,贾桂枝,赵 艳,等.染料木黄酮通过抑制EGFR/ERK通路抗肝癌SMMC7721细胞增殖〔J〕.辽宁医学院学报,2015;36(1):1-3.

8程延安,袁利超,党双锁,等.间断小剂量DEN诱发大鼠肝癌模型研究〔J〕.肿瘤防治杂志,2005;12(11):806-8.

9张志敏,王 阁,陈 川,等.改进性DEN诱发大鼠肝癌模型的建立与病理形态学研究〔J〕.第三军医大学学报,2007;29(12):1164-7.

〔2016-07-27修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R735.7

A

1005-9202(2017)19-4739-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.021

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(No.2013-357)

1 基础医学院 2 病理学教研室 3 免疫学教研室 4 生物化学与分子生物学教研室 5 检验学院

林冬静(1977-)，女，讲师，在读博士，主要从事肿瘤病理生物学研究。