解毒通络方抑制异丙肾上腺素诱导心肌损伤大鼠的胶原合成

王景妍 王博宇 尹延丽 曦 岩 郭家娟 李相军

(长春中医药大学临床医学院，吉林 长春 130116)

解毒通络方抑制异丙肾上腺素诱导心肌损伤大鼠的胶原合成

王景妍1王博宇1尹延丽1曦 岩1郭家娟1李相军2

(长春中医药大学临床医学院，吉林 长春 130116)

目的观察解毒通络方对异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤后胶原合成的干预作用。方法成年Wistar雄性大鼠随机分为对照组、模型组、解毒通络方高、中、低剂量组和ACEI组。解毒通络方组给予解毒通络方冲剂悬液10、20、30 g/kg灌胃，ACEI组给予卡托普利水溶液0.005 g/kg灌胃，对照组和模型组均给予生理盐水灌胃。7 d后，ELISA法检测各组大鼠血浆血管紧张素(Ang)Ⅱ含量；碱水解法测定心肌组织羟脯氨酸(Hyp)含量；免疫组化方法检测心肌组织Col Ⅰ、Col Ⅲ和TGF-β1表达。结果与对照组比较，模型组血清 AngⅡ含量及心肌Hyp含量均明显升高(P<0.05)，心肌组织Col Ⅰ、Col Ⅲ及TGF-β1蛋白表达明显增加(P<0.05)；与模型组比较，解毒通络方各剂量组血清 AngⅡ含量及心肌 Hyp 含量均降低(P<0.05)，心肌Col Ⅰ、Col Ⅲ和TGF-β1蛋白表达明显减少(P<0.05)；与ACEI组比较，解毒通络方高剂量组TGF-β1蛋白的阳性表达面积减少(P<0.05)。结论解毒通络方可以有效抑制异丙肾上腺素所致的大鼠心肌胶原合成，其机制可能与抑制AngⅡ生成及干扰心肌TGF-β1信号通路有关。

心肌损伤；胶原；血管紧张素Ⅱ；TGF-β1；解毒通络方

心肌纤维化(MF)属于中医学的“心悸”“胸痹”“怔忡”“痰饮”等范畴，是指心肌组织中的胶原纤维过量沉积，胶原容积分数和胶原浓度显著增加，各型胶原比例失调以及排列紊乱，可导致心室顺应性下降，影响心脏的正常收缩与舒张，是多种常见心脏疾病走向终末期心脏病发展的一个必然过程，是心功能由代偿期向失代偿期转变的关键〔1〕。阻止或逆转心肌纤维化是延缓心力衰竭、减少心律失常发生的重要手段〔2〕。检测心肌组织中胶原浓度和胶原容积是界定心肌纤维化的金标准。目前认为，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的激活是导致心肌纤维化的主要因素，而血管紧张素(Ang)Ⅱ是RAAS中起主要生物学效应的物质〔3〕。靳宏光等〔4〕发现解毒通络方中的药物有降低AngⅡ的作用。AngⅡ可刺激转化生长因子(TGF)-β1表达，也可刺激体外培养的大鼠新生心肌成纤维细胞促进对TGF-β1的旁分泌而致心肌肥大〔5〕。本研究进一步探讨解毒通络方对心肌纤维化初期胶原合成的干预作用及作用机制。

1 材料与方法

1.1药物与试剂 解毒通络方(夏枯草颗粒剂、牛膝颗粒剂和茺蔚子颗粒剂，均由长春中医药大学第一附属医院制剂室提供)；卡托普利(25 mg/片，杭州民生药业有限公司，批号：T15H048)；盐酸异丙肾上腺素(Sigma-adrich，批号：1351005)；一步法聚合物检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：16G76D07)；浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K152317J)；羟脯氨酸试剂盒(碱)(南京建成生物工程研究所，批号：KGT030-2)；大鼠AngⅡ ELISA试剂盒(上海美轩生物科技有限公司，批号：MEXN-R1019)。

1.2主要仪器 FAIO04电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)、OlympusDX40光学显微镜(日本Olympus公司)、光学显微照相系统(日本Olympus公司)、酶联免疫检测仪(华东电子集团医疗装备有限责任公司)、可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

1.3实验动物及分组 将 30只特殊清洁级(SPF)雄性 Wistar 大鼠(体重180～200 g，由吉林大学医学院动物实验中心提供)随机分为对照组、模型组、解毒通络方低剂量组、中剂量组、高剂量组及血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)组。除对照组外，其余各组均行盐酸异丙肾上腺素腹腔注射(5 mg/kg 体重)，以复制大鼠心肌纤维化模型。造模当天，解毒通络方高、中和低剂量组大鼠按相应剂量(30、20、10 g/kg)灌胃给药，ACEI组大鼠灌服卡托普利水溶液(0.005 g/kg)，其余各组灌服等体积生理盐水。于造模后7 d处死大鼠，取心脏进行相关指标检测。

1.4血清AngⅡ检测 按ELISA试剂盒使用说明书进行血清 AngⅡ检测，主要步骤：①每凹孔加入50 μl用稀释缓冲液稀释的含抗原的心肌组织标本，对照孔加蒸馏水50 μl，30℃作用30 min。②洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液洗5次，每次1 min。③各孔加入50 μl辣根过氧化物酶标记的检测抗体溶液，对照孔不加，37℃作用30 min。④洗涤：移去包被液，凹孔用洗涤缓冲液洗5次，每次1 min。⑤所有孔加入底物A，B各50 μl，37℃避光孵育10 min。⑥每孔加终止液50 μl。⑦观察记录结果：用酶标仪在450 nm波长下测量OD值。

1.5心肌组织羟脯氨酸(Hyp)测定 取100 mg心尖心肌组织，用碱水法，按照试剂盒说明，在λ=550 nm 波长处用分光光度法测定心肌组织Hyp的含量，所得值/0.134即为心肌中胶原蛋白的含量。

1.6观察心肌Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)和TGF-β1蛋白的表达 采用免疫组化方法，切片置于二甲苯Ⅰ15 min，二甲苯Ⅱ15 min，无水酒精，95%、85%、75%酒精各2 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min，微波炉抗原修复(枸橼酸钾液为抗原修复液)，冷却至室温，PBS浸泡5 min反复3次，3% H2O2去离子水孵育5 min，滴加一抗(Col Ⅰ、Col Ⅲ，稀释度均为1∶100；TGF-β1稀释度均为1∶200)，4℃过夜；PBS 浸泡5 min反复3次，每张切片滴加生物素化二抗(PV-6000山羊抗兔/小鼠IgG/HRP聚合物)，37℃恒温孵育20 min，DAB 镜下观察显色；反应结束后光学显微镜下观察染色，阳性染色结果显示为细胞质的棕黄色颗粒；苏木素复染、脱水、透明封片后镜下检测。采用Image J图像分析，测量阳性表达面积均值。

1.7统计学方法 采用SPSS19.0软件行方差分析，两两比较采用最小显著差法(LSD)。

2 结 果

2.1解毒通络方对大鼠血清AngⅡ含量的影响 模型组血清 AngⅡ含量明显高于对照组(P<0.05)，解毒通络方各剂量组血清 AngⅡ含量明显低于模型组(P<0.05)，解毒通络方各剂量组与ACEI组无明显差异(P>0.05)，见表 1。

2.2解毒通络方对大鼠心肌组织Hyp含量的影响 模型组心肌组织Hyp含量明显高于对照组(P<0.05)，解毒通络方低、中剂量组心肌组织Hyp含量明显低于模型组(P<0.05)，解毒通络方各剂量组与ACEI组无明显差异(P>0.05)，见表1。

2.3解毒通络方对心肌胶原蛋白表达的影响 模型组Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白的阳性表达面积值均明显高于对照组(P<0.05)，而解毒通络方低、中剂量组Col Ⅰ蛋白的阳性表达面积值低于模型组(P<0.05)，解毒通络方中、高剂量组Col Ⅲ蛋白的阳性表达面积值低于模型组(P<0.05)，而Col Ⅰ、Col Ⅲ蛋白的阳性表达面积值在解毒通络方各剂量组与ACEI组无明显差异(P>0.05)，见表2。

表1 各组大鼠血清AngⅡ及心肌组织Hyp含量比较

与对照组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05

表2 各组大鼠心肌组织Col Ⅰ、Col Ⅲ阳性表达面积比较

与模型组比较:1)P<0.05；与对照组比较:2)P<0.05

2.4解毒通络方对心肌TGF-β1蛋白表达的影响 模型组TGF-β1蛋白的阳性表达面积值〔(11.50±1.98)%〕明显高于对照组〔(4.30±1.70)%,P<0.05〕，解毒通络方低、中、高剂量组TGF-β1蛋白的阳性表达面积值〔(9.50±1.41)%,(7.60±1.41)%,(6.70±0.42)%〕明显低于模型组(P<0.05)，而ACEI组〔(11.50±1.98)%〕高于解毒通络方高剂量组(P<0.05)。

图1 各组大鼠心肌 Col Ⅰ免疫组化结果(×200)

图2 各组大鼠心肌 Col Ⅲ免疫组化结果(×200)

图3 各组大鼠心肌 TGF-β1免疫组化结果(×200)

3 讨 论

由于心肌损伤的致病原因很多，且临床表现无特异性，故中医临床诊疗需要辨病与辨证相结合，因人、因时、因病情而遣方用药，以发挥中医药特色。黄永生教授根据多年临床实践经验提出以解毒通络方治疗心肌损伤，并且认为其病机关键为“毒伤血络”。毒之产生为阴阳失衡，脏腑功能失调，气血运行失畅，进而使体内的生理或病理产物不能及时排出，蕴结于体内对机体造成损伤。本着治病求本的原则，本方由夏枯草、牛膝、茺蔚子组成，其中夏枯草味苦辛、性寒，有疏通气血的功效，其通络散结之能恰以调畅营气以散毒，是该方的君药；牛膝味甘酸，性平，具有补益肝肾，滋阴潜阳之功，为臣药；茺蔚子味辛甘、微苦、微寒，性凉，具顺气活血化瘀之功，祛瘀而通，上行而下达为佐使药。三药组合可使肝肾阴阳平衡，气血畅通，营行毒除而通络。通过多项实验证实此三味药在某种程度上有类似 ACEI的作用机制〔6〕。动物实验及体外培养的成纤维细胞研究表明，经ACEI治疗或处理后能减少胶原合成，从而预防和逆转心肌纤维化〔7〕，其主要机制为降低循环和心脏局部Ang Ⅱ的浓度。这是ACEI发挥其抗纤维化作用的主要途径，在此作为阳性对照探讨解毒通络方的作用机制。

有研究表明，RAAS在心肌纤维化过程中扮演了关键角色，该系统的激活可使循环和心肌局部的 Ang Ⅱ浓度增加，进而通过释放、激活一系列细胞因子如TGF-β1，引起细胞外基质大量增生和过度积聚，导致心肌纤维化发生〔8〕。Hyp含量的高低在心肌纤维化的评估中有重要意义，可反映心肌胶原蛋白的含量，从而判断心肌间质细胞增殖和纤维增生的程度。本研究表明，异丙肾上腺素激活RASS中Ang Ⅱ释放，可诱导大鼠心肌胶原合成增加，加速心肌纤维化的进程。解毒通络方可以通过抑制RAAS中Ang Ⅱ的释放，进而减少心肌胶原蛋白的含量，进一步阻止心肌纤维化的发展进程。

心肌胶原有5种，以Ⅰ、Ⅲ型为主，Ⅰ型约占心肌胶原总数的80%，纤维粗，有较大的僵硬度和很强的抗牵拉特性，用于保持室壁的强度；Ⅲ型约占11%，纤维较细，伸展性和弹性较大，与室壁弹性有关。解毒通络方可不同程度改善Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的沉积，从而干预心肌纤维化的形成。TGF-β1是一种多功能的蛋白肽，能增加以胶原为主的间质蛋白质的合成，为诸多因素导致心肌纤维化最后的共同中介之一。近年研究还发现，RAAS激活、Ang Ⅱ增高引起心肌损伤、心室重构均与 TGF-β1 增加有关，在心肌纤维化病程中，Ang Ⅱ可上调 TGF-β1受体表达，增强TGF-β1作用的敏感性，而TGF-β1则抑制细胞外基质降解、增加细胞外基质mRNA表达和蛋白质合成〔9，10〕。本研究可见，解毒通络方可有效降低心肌组织中TGF-β1蛋白的表达，抑制细胞外基质合成、增加其降解。

综上，解毒通络方通过抑制被异丙肾上腺素激活的RASS中AngⅡ的释放，而影响TGF-β1蛋白的合成，通过降低蛋白的合成和增加蛋白酶抑制物水平而阻滞基质降解，最终促进心肌纤维化发生及发展〔11，12〕，其作用机制与ACEI类药物相似。

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〔2017-01-15修回〕

(编辑 徐 杰)

R285.5

A

1005-9202(2017)19-4719-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.013

国家自然科学基金青年科学基金项目(81503544)

1 长春中医药大学附属医院心病科 2 吉林大学药学院

郭家娟(1978-)，女，主任医师，硕士生导师，主要从事中医心血管病证研究。

王景妍(1990-)，女，硕士，主要从事中医心血管病证研究。