榧籽油的金松酸结构鉴定及成分分析

毛家辉，赵晨伟，王建峰，周宇驰，田 华，金青哲，王兴国

(1.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122； 2.浙江柏灵农业发展股份有限公司，浙江 金华321000)

检测分析

榧籽油的金松酸结构鉴定及成分分析

毛家辉1，赵晨伟1，王建峰2，周宇驰2，田 华2，金青哲1，王兴国1

(1.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122； 2.浙江柏灵农业发展股份有限公司，浙江 金华321000)

通过红外光谱法和气相色谱-质谱联用法分析了榧籽油所含的特殊脂肪酸——金松酸的结构，并对不同产地香榧籽油和木榧籽油的脂肪酸和主要微量成分组成进行了分析。结果表明：榧籽油主要含有亚油酸(39.85%～46.15%)、油酸(22.68%～35.10%)、金松酸(9.13%～12.96%)、棕榈酸(7.34%～8.22%)、硬脂酸(2.64%～3.03%)等9种脂肪酸；其中，金松酸是一种特殊脂肪酸，其结构为顺5,11,14-二十碳三烯酸；榧籽油主要含有β-生育酚(1 325.75～1 769.06 mg/kg)、β-谷甾醇(921.87～1 167.91 mg/kg)、α-生育酚(208.69～272.20 mg/kg)等7种微量成分。

榧籽油；金松酸；脂肪酸；微量成分

榧树属裸子植物红豆杉科(Taxaceae)榧属(Torreya)常绿乔木。榧树(T.grandis)产于浙江、安徽南部、福建北部、江西东北部，星散分布于贵州、江苏、湖南，以浙江最多[1]。榧树的种子“香榧”是中国特有的珍稀干果之一，其营养价值高，有独特的风味和药用功能，药食两用[2]。但榧树直接用种子繁殖，往往不能保持母本树原有的性状，容易发生变异。榧树所结果实“木榧”形状圆大，壳厚，种仁很硬且口味差，常用于中药材[3]。

研究表明，榧籽由于其营养丰富、含生物活性成分，具有多种生物功能，包括抗氧化、抗炎、抗病毒、抗动脉粥样硬化、抗蠕虫、镇咳、驱风、抗真菌、抗细菌和抗肿瘤等特性[4-6]。因此，榧籽不仅是功能性食品的重要原料，还可作为中药的药材来源。

榧籽种仁含油率高达54.62%～61.47%，以油酸、亚油酸为主，还含有棕榈酸、硬脂酸等，不饱和脂肪酸占脂肪酸总量的76.1%～82.0%[7]。有研究报道，香榧和日本榧脂肪酸种类几乎相同，均含有一种特殊脂肪酸——顺5,11,14-二十碳三烯酸，即金松酸，含量为6.68%～11.20%[8-9]。研究表明，金松酸能通过减少促炎因子的产生达到抗炎效果，且对大鼠的血脂调节具有显著作用，并可抑制肝脏和血浆中涉及脂肪酸合成的酶的活性、提高肉毒碱棕榈酰基转移酶和酰基辅酶A氧化酶的活性[9-11]。我国对榧籽油的研究中尚未对其特殊脂肪酸进行明确的结构鉴定。榧籽油中除脂肪酸外，微量成分如生育酚、角鲨烯、甾醇等也是油脂营养与功能评价的重要部分，但目前对榧籽油的微量成分组成尚无详细研究。

为实现对榧籽油组成成分及其保健功能的深入分析，本研究对来自不同地区不同品种的榧籽冷榨制油，对榧籽油的特殊脂肪酸进行结构鉴定，并对其脂肪酸和主要微量成分组成进行分析，为榧籽油作为功能性油脂的开发及香榧的精深加工提供基础资料和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

榧籽：香榧分别产自浙江省诸暨市、新昌市、嵊州市、兰溪市；木榧产自安徽省黄山市，自然风干，备用。

三氟化硼、焦性没食子酸、福林酚试剂等均为分析纯，上海国药试剂公司；2-氨基-2-甲基丙醇，阿拉丁试剂有限公司；混合生育酚标准品，Roche公司(瑞士)；β-生育酚标准品，上海西宝生物科技有限公司；37种脂肪酸甲酯混合标准品、5α-胆甾烷醇标品、BSTFA+TMCS(99∶1)硅烷化试剂，Sigma公司(美国)。

1.1.2 仪器与设备

CA-59-G螺旋榨油机，德国IBG MONFORTS公司；UV-2100分光光度计，上海Unico仪器公司；Waters 1525高效液相色谱仪、2996二极管阵列检测器，美国Waters公司；二乙醇基固相萃取小柱(Diol-SPE，500 mg，6 mL)，美国赛芬公司；7820A气相色谱仪，美国Agilent公司；Trace GC Ultra气相色谱仪、ISQ质谱检测仪，美国Thermo公司。

1.2 实验方法

1.2.1 榧籽油的制取

榧籽样品放置于45℃烘箱中干燥一段时间，控制其水分含量在5%以下。然后将榧籽去壳，螺旋压榨，静置分层后，过滤、离心，得到冷榨榧籽油。

1.2.2 气相色谱-质谱联用法分析金松酸结构

样品前处理参考文献[12-13]：称取200 mg油样，80℃水浴皂化1 h。冷却酸化至pH 2，水洗调节至pH 7。除水后加入1 g 2-氨基-2-甲基丙醇，170℃反应1～1.5 h，冷却至室温。加3 mL三氯甲烷，振摇1 min，水洗，离心分层。取下层溶液加无水硫酸钠，离心，过0.22 μm有机膜，备用。

色谱条件：Trace GC Ultra气相色谱仪； DB-5色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度260℃；载气He，载气流速0.80 mL/min；分流比20∶1；进样量1 μL；升温程序为初始柱温170℃保持0.5 min，再以6℃/min的速度升温至230℃保持15 min。

质谱条件：ISQ质谱检测仪，离子源温度200℃，传输线温度250℃，电离方式EI，扫描范围(m/z)33～350。

1.2.3 榧籽油红外光谱分析

取一定量的榧籽油，按照参考文献[14]进行红外光谱扫描。

1.2.4 脂肪酸组成测定

采用气相色谱法测定榧籽油脂肪酸组成。

样品前处理：称取50 mg油样，65℃水浴皂化30 min，冷却后加入2 mL三氟化硼甲醇溶液，70℃水浴5 min，冷却后，加入2 mL正己烷，振荡，取上层有机相，加入无水硫酸钠，离心取上清液，备用。

色谱条件：7820A气相色谱仪； TRACE TR-FAME色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；氢火焰离子化检测器(FID)；载气N2，燃烧气H2和空气；进样口温度250℃；检测器温度250℃；进样量1 μL，分流比100∶1；N2流速25 mL/min，H2流速30 mL/min，空气流速400 mL/min；升温程序为初始柱温60℃保持3 min，以5℃/min 的速度升温至175℃保持15 min，再以2℃/min 的速度升温至220℃并保持10 min。

采用脂肪酸甲酯混合标准品定性，采用面积归一化法定量。

1.2.5 植物甾醇和角鲨烯测定

参考李志晓等[15]方法，采用气相色谱-质谱联用法测定。

1.2.6 生育酚测定

采用正相高效液相色谱法测定。

样品前处理：称取1.0～1.5 g油样，置于10 mL棕色容量瓶中，加入正己烷溶解，定容后，过0.22 μm有机膜，备用。

色谱条件：Sehperisorb Silica柱(25 cm×4.6 mm×5 μm)；柱温30℃；检测波长295 nm；流动相为正己烷-异丙醇(体积比98.5∶1.5)；流速0.8 mL/min；进样量20 μL。

采用外标法定量，精确称取生育酚标准品，以正己烷为溶剂配制贮备液，低温下保存。将储备液分别稀释，取各质量浓度标准溶液分析，以进样质量浓度为自变量x，峰面积为因变量y，绘制标准曲线，计算线性回归方程和相关系数，结果见表1。

表1 α-生育酚和β-生育酚标准曲线线性回归方程和回归系数

1.2.7 多酚测定

采用紫外分光光度计法测定。

采用二乙醇基固相萃取小柱(Diol-SPE，500 mg，6 mL)提取榧籽油中的多酚类物质[16-17]。

活化SPE柱，称取榧籽油3.0 g，溶于12 mL正己烷后过柱，再分别用6 mL正己烷清洗柱子两次；加入8 mL正己烷-乙酸乙酯(体积比9∶1)过柱；最后加入甲醇洗脱并收集于10 mL容量瓶中，定容后移取5 mL于10 mL容量瓶中，加入0.5 mL福林酚，反应3 min，加入1 mL 10%的碳酸钠溶液，用水定容后避光静置2 h，过0.45 μm膜，测定765 nm波长处的吸光度。

选用焦性没食子酸作标准品，按一定质量浓度梯度稀释后，各点的吸光度维持在0.1～0.8的可信区间内。以焦性没食子酸质量浓度为自变量x，吸光度为因变量y，绘制标准曲线，得到线性回归方程y=11.029x+0.046 8，R2=0.999 0。根据标准曲线，计算榧籽油样品中的多酚含量。

2 结果与讨论

2.1 金松酸结构鉴定

2.1.1 金松酸的气相色谱-质谱分析

采用杂环化法对榧籽油进行衍生化，2-氨基-2-甲基丙醇与脂肪酸发生缩合反应，生成相应的噁唑啉，反应如下：

在对含有多个双键的脂肪酸进行气相色谱-质谱分析时，甲酯化预处理和电子轰击粒子化过程中均易发生双键转移，以致无法对双键进行准确定位。电子轰击质谱中，分子离子化时电荷位置优先发生在电离电位低的电子上。因此，将羧基修饰成比碳碳双键中π电子电离电位低的含氮杂环提高了电荷的稳定性，使在EI源中给出电荷定域在含氮环的氮原子上而不是双键位置上的离子，通过连续的自由基引发C—C均裂反应产生系列碎片离子，抑制了脂肪链中碳碳双键的迁移，得到易辨认的显示双键位置信息的质谱[18-19]。金松酸杂环化物的质谱图见图1。

图1 金松酸杂环化物的质谱图

双键位置的判断规则如下：如果含n和n-1个碳原子的碎片离子(羧基部分)的质荷比之差为12而不是14时，表示在n和n+1个碳原子之间存在不饱和双键。研究表明，在C4、C5、C6出现双键时，n和n-1个碳原子的碎片离子(羧基部分)的质荷比之差为13而不是12[13]。由图1可以看出，质荷比140与153之间相差13，且质荷比为140的碎片离子含4个碳原子，质荷比为153的碎片离子含5个碳原子，根据判断规则，在C5和C6之间含有不饱和双键。质荷比为222和234之间相差12，且质荷比为222的碎片离子含10个碳原子，质荷比为234的碎片离子含11个碳原子，根据判断规则，在C11和C12之间含有不饱和双键。同样，质荷比262和274之间相差12，C14和 C15之间含有不饱和双键。因此，金松酸是5,11,14-二十碳三烯酸。

2.1.2 榧籽油的红外光谱分析(见图2)

由图2可以看出，721 cm-1处的吸收峰符合顺式双键C—H弯曲振动的特征吸收(730～655 cm-1) ，而在反式双键C—H弯曲振动的特征吸收980～960 cm-1之间没有出现中强的吸收峰，所以榧籽油中几乎不含反式脂肪酸，即金松酸3个双键均为顺式双键(若金松酸含反式双键，以其10%左右的含量将会在980～960 cm-1之间出现1个中强的吸收峰)。

综上所述，榧籽油中的二十碳三烯酸是顺5,11,14-二十碳三烯酸，即金松酸。

2.2 榧籽油脂肪酸组成分析(见表2)

表2 榧籽油脂肪酸组成 %

注：表中数值为“平均值±SD”。下同。

由表2可以看出，榧籽油的主要脂肪酸中，棕榈酸为7.34%～8.22%，硬脂酸为2.64%～3.03%，油酸为22.68%～35.10%，亚油酸为39.85%～46.15%，顺11,14-花生二烯酸为2.17%～3.51%，金松酸为9.13%～12.96%。木榧和香榧在脂肪酸种类上没有差别，但在含量上差异显著。木榧的油酸和亚油酸比例接近1∶2，香榧的油酸和亚油酸比例接近1∶1.2，而且木榧的金松酸含量明显高于香榧的。由此可知，香榧和木榧在各脂肪酸含量上有明显差异，且木榧的多不饱和脂肪酸含量更高。

2.3 榧籽油主要微量成分组成分析(见表3)

表3 榧籽油主要微量成分组成 mg/kg

生育酚是一种重要的天然抗氧化剂，能有效阻断自由基链式反应，预防和减轻体内细胞膜脂质过氧化损伤，保护细胞膜，清除自由基和预防癌症[20-21]。常见植物油中生育酚常以α-生育酚和γ-生育酚为主，但榧籽油中却以β-生育酚为主。β-谷甾醇是植物中常见的活性物质，具有抗氧化、防止动脉粥样硬化、消炎等多种生理作用[22]。

由表3可以看出，榧籽油微量成分中β-生育酚含量最高，为1 325.75～1 769.06 mg/kg，其次为β-谷甾醇(921.87～1 167.91 mg/kg)，其后为α-生育酚(208.69～272.20 mg/kg)。而角鲨烯、菜油甾醇、豆甾醇、多酚含量较少，其中多酚为天然游离多酚。在后续的实验中发现，若采取热榨法制油，如将榧籽置于160℃高温下烘烤0.5 h后趁热压榨制油，所得榧籽油中多酚含量达61.83 mg/kg，具体原理有待进一步研究。木榧和香榧籽油在微量成分种类上没有差别，但在含量上差异明显。在微量成分的含量上木榧均高于香榧。

相比橄榄油、茶籽油、芝麻油(见表4)，榧籽油的多酚含量最低，角鲨烯含量低于橄榄油和茶籽油，植物甾醇的含量略低于芝麻油但远高于橄榄油和茶籽油。而在生育酚的组成上，榧籽油未检出γ-生育酚、δ-生育酚，但其α-生育酚、β-生育酚及总生育酚均远高于其他3种油。此外，常见植物油往往不含或只含有极少量的β-生育酚，而榧籽油的β-生育酚含量很高，这也是它的一个特征指标。

表4 橄榄油、茶籽油、芝麻油微量成分组成[23] mg/kg

注：n.d.代表未检出。

3 结 论

利用红外光谱法和气相色谱-质谱联用法鉴定了榧籽油所含的特殊脂肪酸——金松酸的结构，并分析了榧籽油的脂肪酸及微量成分组成。金松酸的结构为顺5，11，14-二十碳三烯酸。榧籽油脂肪酸以亚油酸、油酸、金松酸为主，其微量成分以生育酚和β-谷甾醇为主，并发现不同产地不同品种的榧籽油其成分组成有一定差异。

综合考虑脂肪酸及微量成分组成，木榧籽油的营养价值优于香榧籽油。同时，木榧青果的价格在5元/斤左右，香榧青果的价格在25元/斤左右。此外，木榧籽壳厚，种仁硬且口味差，不适合作为坚果食用；而香榧籽壳薄，种仁酥脆，风味俱佳，作为坚果广受欢迎。因此，在未来的榧籽油产业化中，提倡以木榧为油料进行制油，一方面营养价值更高，另一方面成本低且充分利用木榧资源。

[1] 陈振德, 郑汉臣. 榧属植物的研究进展[J]. 国外医药(植物药分册), 1996, 11(4): 150-153.

[2] 王向阳, 修丽丽. 香榧的营养和功能成分综述[J]. 食品研究与开发, 2005, 26(2): 20-22.

[3] 郑仁木. 香榧栽培法[M]. 上海：上海科学技术出版社, 1959:18.

[4] 陈振德, 郑汉臣, 陈志良, 等.香榧子油对实验性动脉粥样硬化形成的影响[J]. 中药材, 2000, 23(9): 551-553.

[5] DONG D D, WANG H F, XU F, et al. Supercritical carbon dioxide extraction, fatty acid composition, oxidative stability, and antioxidant effect ofTorreyagrandisseed oil[J]. J Am Oil Chem Soc, 2014, 91(5): 817-825.

[6] NI Q X, GAO Q X, YU W W, et al. Supercritical carbon dioxide extraction of oils from twoTorreyagrandisvarieties seeds and their physicochemical and antioxidant properties[J]. LWT-Food Sci Technol, 2015, 60(2): 1226-1234.

[7] 黎章矩, 骆成方, 程晓建, 等. 香榧种子成分分析及营养评价[J]. 浙江林学院学报, 2005, 22(5): 540-544.

[8] WOLFF R L, PDRONO F, MARPEAU A M, et al. The seed fatty acid composition and the distribution ofΔ5-olefinic acids in the triacylglycerols of some taxaceae (TaxusandTorreya)[J]. J Am Oil Chem Soc, 1998, 75(11): 1637-1641.

[9] ENDO Y, OSADA Y, KIMURA F, et al. Effects of Japanese torreya (Torreyanucifera) seed oil on lipid metabolism in rats[J]. Nutrition, 2006, 22(5): 553-558.

[10] BERGER A, MONNARD I, BAUR M, et al. Epidermal anti-inflammatory properties of 5,11,14 20∶3: effects on mouse ear edema, PGE2levels in cultured keratinocytes, and PPAR activation[J]. Lipid Health Dis, 2002, 1: 5.

[11] ENDO Y, TSUNOKAKE K, IKEDA I. Effects of non-methylene-interrupted polyunsaturated fatty acid, sciadonic (all-cis-5,11,14-eicosatrienoic acid) on lipid metabolism in rats[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2009, 73(3): 577-581.

[12] 周亮, 刘元法, 金青哲, 等. 瓜蒌籽油理化性质及瓜蒌酸结构分析[J]. 食品科学, 2007, 28(11): 116-118.

[13] ZHANG J Y, YU Q T, LIU B N, et al. Chemical modification in mass spectrometry IV—2-alkenyl-4, 4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids[J]. Biol Mass Spectrom, 1988, 15(1): 33-44.

[14] 中国油脂植物编写委员会. 中国油脂植物[M]. 北京: 科学出版社,1987: 525, 574.

[15] 李志晓, 金青哲, 叶小飞,等. 精炼过程中油茶籽油活性成分和抗氧化性的变化[J]. 中国油脂, 2015,40(8):1-5.

[16] 丁明, 钟冬莲. 茶油中总酚的测定方法[J]. 浙江农业科学, 2010, 1(6): 1369-1371.

[17] 罗凡, 费学谦, 方学智, 等. 固相萃取/高效液相色谱法测定茶油中的多种天然酚类物质[J]. 分析测试学报, 2011, 30(6): 696-700.

[18] 王兴国, 金青哲. 油脂化学[M]. 北京: 科学出版社, 2012: 46-47.

[19] 邹耀洪. 邻氨基苯酚化学修饰试剂用于气相色谱/质谱分析花粉脂肪酸[J]. 分析化学, 2004, 32(6): 747-751.

[20] 宋晓燕, 杨天奎. 天然维生素 E 的功能及应用[J]. 中国油脂, 2000, 25(6): 45-47.

[21] 孙登文, 雷炳福. 维生素 E 抗油脂氧化的功能探讨[J]. 中国油脂, 1996, 21(3): 23-27.

[22] 李万林. 植物甾醇的研究进展概述[J]. 饮料工业, 2013, 16(11): 48-51.

[23] 刘慧敏. 不同植物油微量成分与抗氧化能力的相关性研究[D]. 江苏 无锡: 江南大学,2015.

StructuralidentificationofsciadonicacidandcomponentanalysisofTorreyagrandisseedoil

MAO Jiahui1, ZHAO Chenwei1, WANG Jianfeng2, ZHOU Yuchi2, TIAN Hua2, JIN Qingzhe1, WANG Xingguo1

(1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China; 2.Zhejiang Bailing Agriculture Development Co., Ltd., Jinhua 321000, Zhejiang, China)

The structure of the special fatty acid contained inTorreyagrandisseed oil, sciadonic acid, was analyzed by FT-IR and GC-MS, and the fatty acid composition and main trace components ofTorreyagrandisseed oil from different origins were analyzed. The results showed thatTorreyagrandisseed oil mainly contained nine kinds of fatty acids, such as linoleic acid (39.85%-46.15%), oleic acid (22.68%-35.10%), sciadonic acid (9.13%-12.96%), palmitic acid (7.34%-8.22%), and stearic acid(2.64%-3.03%). Sciadonic acid was a special fatty acid, and its structure wascis-5,11,14-eicosatrienoic acid. In addition,Torreyagrandisseed oil mainly contained seven kinds of trace components, such asβ-tocopherol (1 325.75-1 769.06 mg/kg),β-sitosterol(921.87-1 167.91 mg/kg), andα-tocopherol(208.69-272.20 mg/kg), etc.

Torreyagrandisseed oil; sciadonic acid; fatty acid; trace component

2016-11-05；

：2017-03-22

毛家辉(1992) ，男，硕士，主要从事特种油脂方面的研究工作(E-mail) 310961916@qq.com。

赵晨伟，工程师，硕士(E-mail) chenwei_zhao@163.com。

TS225.6；TS227

：A

：1003-7969(2017)07-0135-05