α-生育酚琥珀酸酯对过度运动小鼠NK细胞平衡及ApoE基因表达影响研究

王凤华 ，孔海军，孔令生，黄 玲 ，李赵越

(1.新疆师范大学体育学院，乌鲁木齐 830054； 2.山东中医药大学基础医学院，济南 250031；3.济南艾迪康医学检验中心，济南 250031)

α-生育酚琥珀酸酯对过度运动小鼠NK细胞平衡及ApoE基因表达影响研究

王凤华1，孔海军1，孔令生2，黄 玲3，李赵越1

(1.新疆师范大学体育学院，乌鲁木齐 830054； 2.山东中医药大学基础医学院，济南 250031；3.济南艾迪康医学检验中心，济南 250031)

通过α-生育酚琥珀酸酯作用于过度运动小鼠，观察其对小鼠NK细胞平衡及ApoE基因表达的影响。结果表明：α-生育酚琥珀酸酯对于克服过度运动小鼠免疫抑制现象具有显著作用，主要表现为CD3+、CD16+、CD56+细胞因子极显著下降(P<0.01)；ApoE mRNA及ApoE蛋白表达量极显著上升(P<0.01)。不同剂量α-生育酚琥珀酸酯作用效果有一定差别，高剂量组NK细胞平衡及ApoE表达显著优于低剂量组(P<0.05)。

α-生育酚琥珀酸酯；过度运动；NK细胞；ApoE基因

α-生育酚琥珀酸酯(α-TOS)是α-生育酚的一种酯化衍生物，而α-生育酚则是VE的主要成分。VE是理想的天然抗氧化剂，其抗氧化作用已经得到了国内外学者的广泛认可[1]。由于VE强烈的抗氧化作用，在其运输与储存过程中极易被氧化，因而其酯化衍生物α-TOS应运而生，α-TOS结构较为稳定，不易被氧化，因此α-TOS是VE理想的替代物。

自然杀伤细胞(NK cell)是除T细胞和B细胞之外的另一重要免疫细胞，具有识别免疫靶细胞、杀伤炎性介质的作用[2]。前期研究表明，NK细胞与机体的抗肿瘤、免疫应答具有密切关联。NK细胞按功能不同可分为CD16+、CD56+等分型，通过机体内不同分型NK细胞的表达量可以反应NK细胞反应系统的工作状态[3]。本文旨在探讨不同剂量α-生育酚琥珀酸酯对过度运动小鼠NK细胞平衡及ApoE基因表达影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及试剂

4周龄雄性昆明小鼠40只(购自新疆医科大学动物实验中心，许可证号：SCXX(新)2011-0003)，体重(32.7±2.4)g。

α-生育酚琥珀酸酯(α-TOS，纯度98%)：上海榕柏生物技术有限公司； ELISA酶联免疫试剂盒：南京建成生物公司；DP405 TRNzol总RNA提取试剂盒：天根生化科技有限公司；ApoE mRNA引物：生工生物工程(上海)股份有限公司；一抗、二抗：上海榕柏生物技术有限公司；脱脂奶粉：市售；蛋白抽提试剂盒：上海榕柏生物技术有限公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒、丽春红染色液、硝酸纤维素膜、Quick block封闭液(TBS)、Quick block封闭液(TBST)、超敏ECL化学发光试剂盒、TMB显色液、显影定影试剂盒均购自于碧云天生物技术有限公司。

1.1.2 仪器及设备

5810R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；PCR基因扩增仪：G3000德国Biometra公司；扬天M-6000N凝胶成像系统：美国Alpha Innotech公司；CytoFLEX流式细胞仪：赛默飞世尔科技有限公司；PT-350酶标仪；XSC小鼠恒温泳池；DYY-10C水平电泳仪；DY89-Ⅱ电动玻璃匀浆仪。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物基本情况

实验动物随机分为4组，每组10只，4组分别为运动对照组、运动+低α-TOS组(20 μg/mL)、运动+高α-TOS组(40 μg/mL)、空白对照组，以下分别简称Mc组、T1组、T2组、Rc组。动物统一使用营养饲料饲喂，鼠笼置于23～25℃常温条件下，湿度50%～55%、光照12 h/12 h。Mc组、T1组、T2组小鼠进行6周力竭游泳运动训练，每日进行1次，水温23～25℃，水深35 cm[4]。将小鼠投入恒温泳池内，并在小鼠尾部悬挂10 g重铅垂，使小鼠于温水中进行自由游泳运动，实验者在泳池旁观察，待小鼠出现沉底且沉底超过3次后将其捞起，使用吹风机吹干，避免影响实验动物免疫平衡[5-6]。每次游泳运动前，Mc组、T1组、T2组均进行人工灌胃，灌胃量均为0.2 mL，灌胃药物剂量依次为: 0.75%生理盐水、20 μg/mLα-TOS、40 μg/mLα-TOS。

1.2.2 检验方法

第6周最后一次游泳运动后，即刻摘眼球取血，血液立即离心，取血清，4℃保存备用；取小鼠脾脏，4℃保存备用。

1.2.2.1 细胞标记法检验细胞因子水平

分别使用CD3+、CD16+、CD56+标记NK细胞，使用ELISA 酶联免疫试剂盒及酶标仪进行酶联免疫吸附实验，检测上述细胞因子水平。

1.2.2.2 ApoE mRNA表达检测

取0.2 mL小鼠新鲜全血加入1 mL TRNzol,充分振荡混匀，4℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清，加0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置3 min。4℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20 min。4℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清，使用75%乙醇洗涤沉淀，室温晾干，备用[7]。使用30 μL双蒸水溶解沉淀，进行PCR扩增，引物序列及扩增产物见表1。

表1 PCR引物序列及扩增产物

1.2.2.3 Western Blot 检测ApoE蛋白表达

使用Western Blot半定量法检测小鼠血清及脾脏ApoE蛋白表达量，取小鼠脾脏200 mg匀浆(每次5 s，连续3～5次)，12 000 r/min离心20 min。血清及脾脏匀浆液分别用预冷的PBS缓冲液洗涤2次，加入100 μL RIPA裂解液4℃孵育30 min，12 000 r/min 离心10 min，取上清。经SDS-PAGE电泳后，转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温(TBST缓冲液稀释)密封2 h，一抗室温孵育2 h，TBS洗5次，每次10 min，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，TBST洗5次，每次10 min。ECL显影后在暗室中用Kodak胶片曝光[8]。显影、定影后晾干。将晾干的胶片用M-6000N凝胶影像成像系统拍摄照片。

1.2.3 统计学方法

实验数据分析使用Excel 2010数据包进行图表绘制，SPSS22.0数据包进行显著性差异处理，通过正态检验及方差齐性检验后使用LSD-t检验进行显著性差异分析，P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 小鼠血清NK细胞检测结果(见图1)

由图1可知，通过6周力竭游泳运动实验，实验小鼠CD3+、CD16+、CD56+细胞因子发生波动变化，与Mc组比较，T1组、T2组、Rc组细胞因子含量均极显著低于Mc组(P<0.01)；T1组、T2组相互比较，T2组NK细胞CD3+、CD16+细胞因子剂量显著低于T1组(P<0.05)，CD56+细胞因子间无统计学差异(P>0.05)。

图1 各组小鼠血清CD3+、CD16+、CD56+细胞因子剂量

2.2α-生育酚琥珀酸酯对小鼠ApoE mRNA表达的影响(见图2)

图2 小鼠血液ApoE mRNA电泳图

由图2可知，小鼠血液ApoE mRNA电泳条带清晰，与Mc组比较，T1组、T2组及Rc组灰度值明显高于Mc组。Mc组、T1组、T2组间两两比较可知，随α-TOS剂量上升，凝胶成像下灰度值呈上升趋势。提示α-TOS可能通过诱导机体产生ApoE等活性物质，来对抗应激造成的损害而起到保护机体的作用，其中α-TOS诱导产生ApoE的作用有一定的特异性。

2.3α-生育酚琥珀酸酯对ApoE蛋白表达的影响(见图3、图4)

图3 小鼠血清ApoE蛋白表达

图4 小鼠脾脏ApoE蛋白表达

由图3、图4可知，不同剂量α-生育酚琥珀酸酯干预6周后，Mc组ApoE蛋白发生了大量裂解，ApoE蛋白释放到胞质中，并使ApoE蛋白低表达；随着α-生育酚琥珀酸酯剂量上升，实验动物血清中ApoE蛋白表达量逐渐上升，T1组、T2组与Mc组间存在极显著性差异(P<0.01)。说明此化合物能够保护ApoE蛋白的损失及降解。

3 讨 论

前期研究表明，机体处于过度运动状态时，免疫机能表现为强烈的抑制作用，即Th1细胞亚群表现为免疫应答抑制，Th2则表现为免疫应答领先，易引发机体的急慢性炎症[9-10]。NK细胞系统与T淋巴细胞存在较高的相关性。NK细胞对炎性介质具有较强的杀伤作用，且作用过程中无需特异性抗体介入，可严重干扰机体的免疫过程。NK细胞因子发挥免疫作用的过程与T淋巴细胞因子活性存在广泛联系，如IL-2可作用于NK的分化过程，而NK又可分泌INF-γ，同时促进Th2亚群中IL-4、IL-6、TNF-α等细胞因子的分化[11]。

ApoE是介导机体免疫应答的重要基因，主要在脾脏和脑组织中生成，广泛参与细胞的免疫调节。机体过度运动状态下，体内产生大量自由基等强氧化物，细胞裂解作用加强，T淋巴细胞因子大量增殖，可造成部分组织的微细结构损伤。ApoE可通过阻断T淋巴细胞分化通路，从而转变细胞的免疫抑制状态[12-13]。α-TOS通过增强ApoE mRNA P结合蛋白的吸附作用，提高血液、脾脏中mRNA及相关蛋白表达量。

4 结 论

通过6周不同剂量α-TOS干预，极显著降低过度运动小鼠血清NK细胞CD3+、CD16+、CD56+的含量，其血液ApoE mRNA及血清、脾脏ApoE蛋白表达量极显著上升。说明α-TOS可显著促进机体的免疫平衡，缓解机体的免疫抑制状态。

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Effectsofalpha-tocopherolsuccinateonbalanceofNKcellsandApoEgeneexpressioninexcessivemovementmice

WANG Fenghua1,KONG Haijun1, KONG Lingsheng2, HUANG Ling3, LI Zhaoyue1

(1.Institute of physical Education, Xinjiang Normal University, Urumqi 830054,China; 2.Basic Medical College,Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250031, China; 3.Jinan ADICON Clinical Center, Jinan 250031,China)

Byalpha-tocopherol succinic acting on the excessive movement mice, the effects of it on balance of NK cells and ApoE gene expression in mice were investigated. The results showed that thealpha-tocopherol succinic to overcome immunosuppressive phenomenon of excessive movement mice had significant effect, with CD3+, CD16+,CD56+cells factor decreasing extremely significant (P<0.01),and ApoE mRNA and ApoE protein expression increasing extremely significant (P<0.01). Different concentrations ofalpha-tocopherol succinic had certain different effects. The balance of NK cells and the ApoE expression of high concentration group was obviously better than that of low concentration group (P<0.05).

alpha-tocopherol succinic; excessive movement; NK cell; ApoE gene

2016-12-15；

：2017-04-17

国家自然科学基金(31660736)；新疆维吾尔自治区文科基地招标课题(XJEDU040616C02)；2016年新疆维吾尔自治区研究生科研创新项目(XJGRI2016106)

王凤华(1971)，女，副教授，硕士生导师，博士，研究方向为运动生物化学(E-mail)1057033469@qq.com。

TQ645；R965.1

：A

：1003-7969(2017)07-0132-04