磷酸香草醛法测定不同培养条件下四尾栅藻(Scenedesmusobliquus)总脂含量

张 曼，郜小龙，张 丽，祝伟霞

(1.河南师范大学 水产学院，河南 新乡 453007； 2.河南出入境检验检疫局，郑州 450003)

磷酸香草醛法测定不同培养条件下四尾栅藻(Scenedesmusobliquus)总脂含量

张 曼1，郜小龙1，张 丽2，祝伟霞2

(1.河南师范大学 水产学院，河南 新乡 453007； 2.河南出入境检验检疫局，郑州 450003)

验证了磷酸香草醛反应在不同氮(0.2、2、20、40 mg/L)、磷(0.1、1、10、20 mg/L)质量浓度培养条件下测定四尾栅藻总脂含量的可靠性。结果表明：不同氮、磷质量浓度条件下栅藻总脂含量和磷酸香草醛测定吸光度之间均呈显著的线性回归关系(不同氮质量浓度条件：R=0.997，P=0.003；不同磷质量浓度条件：R=0.994，P=0.006)，在不同氮、磷质量浓度培养条件下该方法的测定结果准确可靠，可以用于栅藻的总脂含量测定。磷酸香草醛反应的显色强度可能与脂肪酸的饱和度有关，为保障该方法测定总脂含量的准确性，用该方法估算总脂含量须在氮、磷质量浓度变化范围内进行预先验证。

微藻；总脂含量；磷酸香草醛反应；测定方法

受能源危机的影响，微藻在生产生物能源方面的潜力备受关注[1]。藻细胞能通过光合作用将太阳能转化为生物能，再通过不同的加工过程生产各种生物燃料。与其他油料作物相比，微藻具有生长速度快、产能高、油脂含量高、抗极端条件能力强等特点[2]。微藻生产的油脂具有产量高、品性好、易于调控和改良等多重优势，目前对于微藻油脂的研究多集中在提高微藻含油量的方法上[3]。但现今微藻生物燃料生产仍面临多重技术困难。其中，对微藻粗脂肪含量的传统测定方法冗繁复杂，是微藻能源开发过程中亟待解决的问题之一[4]。特别是在微藻培养过程的连续监测中，总脂含量测定往往所需藻液体积大，操作复杂费时，不利于培养者及时掌握微藻实时脂肪积累情况。

生物体与磷酸香草醛试剂反应，可以产生一种红色物质，这是磷酸香草醛反应可以用于测定总脂含量的基础。推测认为试剂中的磷酸与香草醛的羟基作用后产生芳香族磷酸酯，并且改变了香草醛分子中的电子分配，使醛基变成酯基；另一方面，不饱和脂肪酸与硫酸作用可以水解生成碳鎓离子。磷酸酯与碳鎓离子发生反应，最终生成红色醌化物，在530 nm处存在最大吸收峰，根据颜色深浅(吸光度)即可定性分析总脂含量的高低。但是需要指出，磷酸香草醛反应的显色强度与脂肪酸的饱和程度有关，也就是说只有在微藻不饱和脂肪酸占总脂含量比例(即脂肪酸饱和度)变化不大的前提下，用磷酸香草醛反应估算总脂含量才是可靠的。李仁民等[5]利用磷酸香草醛反应估算酵母菌的油脂含量。罗玮等[6]也利用磷酸香草醛反应成功估算了丰富栅藻、小球藻、小环藻等多种微藻的油脂含量。

然而，微藻的脂肪酸饱和度在不同氮、磷质量浓度培养条件下可能会受到影响[7-8]。研究[9-10]显示，微藻在缺氮状态下，自身的生长(即蛋白质和核酸合成)受到限制，但其碳同化的过程一直进行，从而进入脂类代谢，提高了甘油三酯含量。有研究[11-12]进一步指出，微藻从氮源正常培养到氮源受限培养，油脂组成也会由富含游离脂肪酸变为甘油三酯。栅藻属是常见的淡水绿藻，生长快速，能大量合成油脂，已成为开辟生物燃料的首选原料。Chen等[13]研究表明通过分批式培养28 d，栅藻的平均生物量产率可达0.105 g/(L·d)(干重)，最高油脂含量可达干重的35%。本文利用四尾栅藻(Scenedesmusobliquus)开展研究，拟通过磷酸香草醛法建立一种快速、高效且灵敏的分析微藻总脂含量的测定方法，用以替代有机溶剂提取法烦琐过程，为实现微藻总脂含量的测定以及用于新能源生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验藻种采用已在水体中成功分离生长迅速的四尾栅藻活性藻株。以HGZ作为微藻的培养基[14]，进行种子液制备。

HGZ培养基配方：NaNO30.3 g/L，KNO30.051 g/L，K2HPO40.049 g/L，MgSO4·7H2O 0.075 g/L，Na2CO30.02 g/L，Ca(NO3)2·4H2O 0.059 g/L，NH4Cl-EDTA 0.0391 g/L，HBO32.86 mg/L，MnCl2·4H2O 1.81 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.222 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.391 mg/L，CuSO4·5H2O 0.079 mg/L，Fe-EDTA 0.932 mg/L。

1.2 实验方法

1.2.1 四尾栅藻的培养

使用调整氮(NaNO3)、磷(K2HPO4)后的HGZ培养基配方对四尾栅藻进行为期14 d的培养。实验分别设置4个磷质量浓度处理组(1～4)和4个氮质量浓度处理组(5～8)，详见表1，每处理组设置3个平行。

表1 处理组的氮、磷质量浓度

实验开始前，取处于稳定生长期的栅藻母液(浓度>109个/mL)离心收集藻细胞，用不含氮、磷源的培养基重新悬浮，待接种。将氮、磷质量浓度配制好的液体培养基置于1 L锥形瓶中进行2 h的高压灭菌，冷却后按照1.2×106个/mL的初始浓度进行接种，置于培养箱中进行为期14 d的培养，光照条件为60 μmol/(m2·s)，培养温度为25℃。收集培养结束的藻液，一部分用磷酸香草醛法测定总脂含量，其余藻液测定体积后置于50 mL离心管中，10 000 r/min 离心3 min后弃上清，并用蒸馏水洗涤2次，将藻泥冷冻干燥2 h，干燥后的藻粉用标准方法测定微藻脂肪含量。

1.2.2 标准方法测定栅藻总脂含量

取100 mg藻粉加入2 mL 10%二甲亚砜-甲醇溶液，分别于50℃抽提30 min、冰浴抽提30 min后，离心收集上清液于预先烘干的玻璃小瓶中，藻渣加入4 mL乙醚-正己烷(体积比1∶1)，冰浴抽提1 h，离心收集上清液至同一玻璃小瓶中，重复上述过程直到藻渣变白。在合并的抽提液中加入纯水，使二甲亚砜-甲醇、水、乙醚、正己烷的比例为1∶1∶1∶1(体积比)，振荡分相，移取有机相至另一玻璃小瓶中，在通风橱中用氮气吹至较小体积，将浓缩液转移至预先称重的1.5 mL塑料离心管中，用氮气吹干至恒重，即得总脂含量[15]。

1.2.3 磷酸香草醛法测定栅藻总脂含量

磷酸香草醛试剂：0.12 g香草醛溶解于20 mL蒸馏水中，用85%的磷酸定容至100 mL。

测定方法：将培养浓度大于106个/mL的藻液取出，准确量取体积1 mL，于10 000 r/min离心5 min，用蒸馏水重新定容至1 mL(以蒸馏水为参照)，加入10 mL具塞比色管中，加入2 mL 18 mol/L H2SO4，于沸水浴中孵化10 min，常温水浴孵化10 min，加5 mL磷酸香草醛试剂，37℃保温15 min，再常温水浴10 min，于530 nm处测定吸光度。

1.2.4 数据分析

取平行样品的均值作相关分析的计算。用Pearson相关分析被测指标之间的相关系数。设定P<0.05具有显著差异。数据用“平均值±标准差”表示，用统计分析软件SPSS 16.0进行线性回归分析。用Excel软件进行数据录入和基本作图。

2 结果与分析

2.1 磷酸香草醛测定吸光度与标准法测定总脂含量(见表2、图1)

表2 磷酸香草醛测定吸光度与标准法测定总脂含量

图1磷酸香草醛法测定吸光度与末期栅藻浓度的相关性

从表2、图1可以看出，在收获末期，磷酸香草醛法测定的吸光度(y)和末期栅藻浓度(x)之间存在显著的线性相关关系(y=0.006 7x-0.000 9，R=0.963，P<0.001)，表明在培养条件范围内，磷酸香草醛法测定的脂肪酸浓度和末期栅藻浓度呈正比。标准方法测定总脂含量(y)与末期栅藻浓度(x)也呈显著的线性相关关系(y=2.148 1x-0.244 2，R=0.934，P=0.001)，表明总脂含量和末期栅藻浓度呈正比。

2.2 磷酸香草醛法测定不同氮、磷质量浓度条件下栅藻油脂含量

从表2可以看出，随着氮、磷质量浓度增高，总脂含量均随之增加。在不同磷质量浓度条件下，磷酸香草醛法测定的吸光度(x)与标准方法测定总脂含量(y)之间存在显著的线性相关关系(y=326.2x+0.056，R=0.994，P=0.006)。在不同氮质量浓度条件下，磷酸香草醛法测定的吸光度(x)与标准方法测定总脂含量(y)之间也存在显著的线性相关关系(y=314.2x-0.104，R=0.997，P=0.003)。综合不同氮、磷质量浓度培养条件来看，磷酸香草醛法测定的吸光度(x)和标准方法测定总脂含量(y)之间也存在显著的线性相关关系(y=326.23x-0.182 1，R=0.994，P=0.000)，表明磷酸香草醛法用于测定栅藻总脂含量具有可行性。

3 结 论

本文利用磷酸香草醛反应测定了四尾栅藻总脂含量，结果表明在不同磷、氮质量浓度条件下该方法的测定结果准确可靠，可以用于在该培养条件下栅藻的总脂含量测定。

与磷质量浓度培养条件变化相比，在不同氮质量浓度条件下栅藻总脂含量和磷酸香草醛测定吸光度之间线性回归的斜率相近，综合不同氮、磷质量浓度培养条件来看，栅藻总脂含量和磷酸香草醛法测定吸光度之间线性关系显著，这表明在不同氮、磷质量浓度条件下，利用磷酸香草醛反应的显色强度测定总脂含量是准确可靠的。本研究中，根据磷酸香草醛反应的原理，只要栅藻中不饱和脂肪酸占总脂含量的比例不发生变化或变化不大，利用该反应测定藻类总脂含量就是可行的。推测本实验中，栅藻在不同氮、磷质量浓度条件下，油脂中不饱和脂肪酸含量变化不大，这是利用磷酸香草醛反应成功测定总脂含量的主要原因。利用磷酸香草醛反应进行藻类总脂测定的过程中不需要复杂的实验仪器，测定方法快速准确，特别适用于大规模分析及连续监测。但磷酸香草醛反应的显色强度与脂肪酸的饱和度有关，用磷酸香草醛反应估算总脂含量需要进行预先验证才是可靠的。正确利用该方法能够快速测定微藻总脂含量，为能源微藻总脂测定开辟了一种新的途径。

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Phosphoricacid-vanillindeterminationoftotalfatcontentofScenedesmusobliquusunderdifferentcultivationconditions

ZHANG Man1, GAO Xiaolong1, ZHANG Li2, ZHU Weixia2

(1.College of Fisheries, Henan Normal University, Xinxiang 453007, Henan, China；2.Henan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhengzhou 450003, China)

The reliability of measuring total fat content ofScenedesmusobliquususing the phosphoric acid-vanillin reaction under different nitrogen (0.2, 2, 20, 40 mg/L) and phosphorus (0.1, 1, 10, 20 mg/L) mass concentration cultural conditions was studied. The results showed that there were significantly linear regression relationships between total fat content and absorbance value of phosphoric acid-vanillin determination under different nitrogen and phosphorus mass concentrations (different nitrogen mass concentration conditions:R=0.997,P=0.003; different phosphorus mass concentration conditions:R=0.994,P=0.006). This method was accurate and reliable under different phosphorus and nitrogen mass concentrations. It could be used to determine the total fat content ofScenedesmus. The color intensity of phosphoric acid-vanillin reaction was associated with the saturation degree of fatty acids. Therefore, the range of nitrogen and phosphorus mass concentration should be verified to ensure the accuracy before using this method.

microalgae; total fat content; phosphoric acid-vanillin reaction; determination method

2016-10-08；

：2017-02-16

国家自然科学基金(31400397)；河南省教育厅资助项目(14B240004)；河南师范大学博士启动金资助项目(QD13048)。

张 曼(1982)，女，副教授，博士，主要从事水域生态学研究工作(E-mail)zm0378@163.com。

TS222; Q949

：A

：1003-7969(2017)07-0120-04