栀子油对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用

张风波，罗光明，肖日传，袁源见，饶雅琪，李 波，谢 晶

(江西中医药大学 药学院，南昌 330004)

栀子油对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用

张风波，罗光明，肖日传，袁源见，饶雅琪，李 波，谢 晶

(江西中医药大学 药学院，南昌 330004)

研究栀子油对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用，并探讨其保肝作用机制。采用四氯化碳小鼠急性肝损伤模型，测定小鼠血清中ALT、AST活性，TBA、TBIL、DBIL水平，肝组织中SOD活力及MDA、GSH的水平，用HE染色切片对肝组织进行病理学观察，考察栀子油各剂量组对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用。结果表明：与模型组相比，栀子油中剂量组(0.6 g/kg)、高剂量组(1.2 g/kg)可显著改善四氯化碳所致急性肝损伤小鼠的肝脏组织病理学变化，显著降低肝损伤小鼠血清中ALT、AST的活性和TBA、TBIL、DBIL的水平；栀子油高剂量组可提高肝匀浆中SOD活力和GSH水平，降低MDA含量。栀子油对四氯化碳所致急性肝损伤小鼠具有保肝作用，其机制可能与降酶、抑制自由基脂质过氧化、维持肝细胞膜正常形态有关。

栀子油；肝损伤；脂质过氧化；保肝

栀子为市面上常见大宗药材之一，来源于茜草科植物栀子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果实[1]，主要产于江西、湖南、福建等省，是江西省道地药材[2]。栀子中主要含有环烯醚萜类、有机酸类和栀子黄色素等成分，栀子性苦味寒，具有泻火除烦、凉血解毒的功效[3-5]。现代药理学研究表明，栀子具有保肝利胆、镇静、降压、消炎等多种药理作用[6-7]。

目前国内外对栀子现代药理研究及药物开发主要是针对环烯醚萜类成分，少有对栀子油进行药理研究，而栀子中栀子油含量很高[8]，为进一步综合开发利用栀子的临床价值，本文探讨栀子油对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的影响及其可能的保护机制，为临床防治肝病的新药研发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级昆明种雄性小鼠，体重18～22 g，共60只，由山东省实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(鲁)20140007。动物房温度20～25℃，湿度55%～75%。

1.1.2 药品与试剂

栀子由江西省九江市湖口县顺昌栀子药材基地提供，经江西中医药大学中药资源学科罗光明教授鉴定为茜草科植物栀子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果实，药材存放于江西中医药大学实验大楼C座种质资源室；丙氨酸氨基转移酶(ALT，批号：20160917)、天门冬氨酸转移酶(AST，批号：20160917)、总胆汁酸(TBA，批号：20160918)、总胆红素(TBIL，批号：20160918)、直接胆红素(DBIL，批号：20160917)、总蛋白(TP，批号：20160918)、还原型谷胱甘肽(GSH，批号20160611)、超氧化物歧化酶(SOD，批号：20160918)和丙二醛(MDA，批号：20160917)试剂盒，均购于南京建成生物工程研究所。联苯双酯滴丸(浙江万邦药业股份有限公司，生产批号：160605，每丸1.5 mg)；食用性花生油，购于江西南昌金海棠药用油有限公司，批号：160610；四氯化碳、吐温-80，均购于西陇化工股份有限公司。

1.1.3 主要仪器

UV-1800型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；MULTISKAN GO酶标仪，赛默飞世尔科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 栀子油的提取[9]

取干燥后的栀子，粉碎，过20目筛，加5倍量的石油醚，85℃索氏提取3 h，提取结束后用旋转薄膜蒸发仪回收石油醚，得栀子油，于4℃保存备用。

1.2.2 四氯化碳肝损伤模型的建立[10]

取60只昆明小鼠随机分为6组，分别为正常对照组、四氯化碳肝损伤模型组、栀子油低剂量组(0.3 g/kg)、栀子油中剂量组(0.6 g/kg)、栀子油高剂量组(1.2 g/kg)、联苯双酯组(200 mg/kg)。正常对照组和模型组小鼠给予灌服等量的0.5%吐温-80溶液，其他各组小鼠灌服相应的药物，连续给药7 d 后，除正常对照组腹腔注射纯花生油外，其余各组分别腹腔注射0.15%四氯化碳(用精制花生油配制，0.15 mL/10 g)，16 h后摘眼球取血同时取肝组织。全血3 000 r/min离心10 min，取上层血清，检测ALT、AST、TBA、DBIL、TBIL各项指标；取0.1 g肝脏组织，用4℃生理盐水制成10%的肝匀浆，离心，取上清液，检测TP、SOD、MDA、GSH各项生化指标；各指标的检测均按其试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 肝脏组织学分析

取各组小鼠肝脏相同部位的肝组织，用10%甲醛溶液固定，之后进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片展片、HE染色，最后置光镜下观察肝组织的损伤程度。

1.2.4 数据分析

数据均以“均值±标准差”表示(n=10)，采用数据分析软件Graph Pad Prism 5进行单因素方差分析，组间差异采用t检验，p<0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 栀子油对急性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性和TBA、TBIL、DBIL水平的影响(见表1)

表1 栀子油对急性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性和TBA、TBIL、DBIL水平的影响

注：相对于正常对照组，△表示p<0.05，△△表示p<0.01，△△△表示p<0.001；相对于模型组，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。下同。

由表1可知，模型组小鼠血清ALT、AST活性及TBA、TBIL、DNIL水平非常显著高于正常对照组(p<0.001)，表明四氯化碳急性肝损伤模型很成功；与模型组相比，栀子油中剂量组显著降低急性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性(p<0.05)；栀子油中剂量组、高剂量组的TBA、TBIL水平具有显著性降低(p<0.05)；比较DBIL水平则栀子油中剂量组具有极显著性降低(p<0.01)，栀子油高剂量组非常显著性降低(p<0.001)。同样，与模型组比较，联苯双酯组非常显著降低肝损伤小鼠血清ALT、AST活性及DBIL水平(p<0.001)，极显著性降低TBA水平(p<0.01)，显著降低TBIL水平(p<0.05)。

2.2 栀子油对急性肝损伤小鼠肝组织SOD活力及MDA、GSH水平的影响(见表2)

表2 栀子油对急性肝损伤小鼠肝组织SOD活力及MDA、GSH水平的影响

由表2可知，相比正常对照组，四氯化碳诱导的模型组小鼠产生了显著的氧化还原反应，表现在肝组织中MDA水平的非常显著提高(p<0.001)及SOD活力、GSH水平的非常显著降低(p<0.001)。与模型组相比，栀子油低剂量组、中剂量组MDA水平均有极显著性差异(p<0.01)，栀子油高剂量组MDA水平具有非常显著性差异(p<0.001)；比较栀子油各剂量组与模型组GSH水平和SOD活力，栀子油高剂量组具有极显著性差异(p<0.01)；与模型组比较，联苯双酯组SOD活力、MDA和GSH水平均具有极显著性(p<0.01)或显著性差异(p<0.05)。从以上结果可得联苯双酯组及栀子油各剂量组都显著降低四氯化碳诱导的小鼠肝组织氧化应激反应，具有显著的降酶、抑制自由基生成等保肝作用。

2.3 肝脏病理学检查(见图1)

图1 栀子油对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的肝组织病理组织学的影响(HE×40)

由图1可见，在高倍光学显微镜下观察各组肝脏病理学切片，正常对照组小鼠肝脏的肝小叶结构正常，肝细胞明显呈以中央静脉为中心放射状排列，同时肝细胞基本都呈正常形态；肝损伤模型组小鼠肝小叶结构发生紊乱，肝细胞出现明显的纤维化，细胞核有明显聚集，也有清晰可见的坏疽；联苯双酯组小鼠肝小叶结构大致恢复正常态，组织结构相对完整；与肝损伤模型组进行比较，栀子油中、高剂量组的肝细胞变性、坏死情况明显降低，说明其肝损伤情况有所改善。

3 讨 论

四氯化碳肝损伤模型是经过氧化胁迫和脂质过氧化诱导肝脏损伤[11]，是一个非常经典的急性肝损伤的模型，四氯化碳进入体内后进行肝脏酶系统代谢，通过细胞色素P450及结合反应的中间代谢产物最终生成CCl3OO自由基，进一步会对细胞膜、线粒体、内质网等具膜物质进行攻击，进而引起肝细胞膜脂质过氧化[12]，细胞膜的破坏会引起肝细胞通透性改变甚至凋亡，而丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸转移酶(AST)存在于肝细胞内，当细胞膜遭到破坏，导致其大量进入血浆中，进而使血清中ALT和AST的活力显著增强，血清ALT和AST活力亦是检测肝损伤程度的敏感指标[13]。总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)的正常代谢依赖于肝细胞，肝细胞受损时对其清除能力降低，导致其水平上升。总胆汁酸(TBA)是在肝脏内合成以及代谢，是在肝脏酶系统代谢下由胆固醇转化得到，故TBA可以作为对肝损伤程度的评价指标[14]。超氧化物歧化酶(SOD)是机体清除自由基的特异性酶，SOD活性的降低直接表明机体内自由基产生的增加；丙二醛(MDA)是脂质过氧化反应的一个重要产物，其含量的高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的程度[15]；还原型谷胱甘肽(GSH)为解除毒素的特效物质，是一种小分子肽，作为体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，其被自由基的消耗程度也反映了肝损伤的程度。

4 结 论

本实验中，栀子油中剂量组(0.6 g/kg)、高剂量组(1.2 g/kg)与模型组进行比较，小鼠血清中ALT、AST活性，TBA、DBIL和TBIL水平均显著下降，效果近乎达到联苯双酯组水平，说明栀子油对脂质过氧化有减弱效果，进而对四氯化碳所致小鼠肝损伤有保护作用；栀子油高剂量组显著升高小鼠肝脏中SOD活力、GSH水平、降低MDA水平，表明一定剂量的栀子油可以通过提升SOD活力与GSH水平来抑制MDA的生成，阻止肝细胞进一步脂质过氧化，减少自由基的生成，维持肝细胞膜的正常形态，降低肝细胞的损伤程度。以上情况说明，降酶、抑制自由基脂质过氧化、维持膜正常态可能就是栀子油具有保肝功能的机制。

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ProtectiveeffectofGardeniaoiloncarbontetrachlorideacuteliverinjuryinmice

ZHANG Fengbo，LUO Guangming，XIAO Richuan，YUAN Yuanjian，RAO Yaqi，LI Bo，XIE Jing

(School of pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China)

The protective effect ofGardeniaoil on carbon tetrachloride acute liver injury in mice was studied and its protective mechanism was investigated. The activities of ALT, AST and levels of TBA, TBIL, DBIL in serum, the activities of SOD and levels of MDA and GSH in liver tissue were measured and pathological morphological in liver tissues were monitored by HE staining section in carbon tetrachloride acute liver injury mice. The protective effect of different doses group ofGardeniaoil on carbon tetrachloride acute liver injury in mice was discussed. The results showed that compared with model group, middle dose group (0.6 g/kg) and high dose group (1.2 g/kg) ofGardeniaoil could significantly improve the pathological changes of liver tissue in carban tertrachloride acute liver injury mice, and could significantly reduce the activities of ALT, AST and the levels of TBA, TBIL, DBIL in serum. High dose group (1.2 g/kg) ofGardeniaoil could improve the SOD activity and GSH level, and reduce the MDA content in liver homogenate.Gardeniaoil had a significant hepatoprotective effect on carbon tetrachloride induced liver injury mice. The mechanism might be related to enzyme decreasing, inhibition of free radical lipid peroxidation and maintenance of normal morphology of hepatic cells.

Gardeniaoil; liver injury; lipid peroxidation; hepatoprotective

2016-11-21；

：2017-04-21

国家公益性科研专项(201507002)

张风波(1992)，男，在读硕士，研究方向为中药资源开发与应用(E-mail)1006365094@qq.com。

罗光明，教授，博士生导师(E-mail)jzlgm88@163.com。

TS225.1；R965.1

：A

：1003-7969(2017)07-0128-04