藻-菌混合培养及添加NaHCO3促进栅藻生长和脂类合成

王雪晴，邢向英，董庆霖，燕 然，李文娜

(1.河北工业大学 化工学院，天津 300130； 2.河北工业大学 代谢工程实验室，天津 300130)

微藻生长速率快[1]，易于培养，脂类含量高[2]，是生产生物柴油的主要原料[3-5]。然而，与化石燃料相比，生物柴油的生产成本仍然较高，无法实现可持续的商业化生产[6-8]。因此，如何提高微藻产量和脂类含量是生物柴油原料生产的关键问题。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 藻种及培养基

栅藻(Scenedesmusobliquus)培养液(含杂菌)购自中科院武汉水生生物研究所。

1.5N-BBM培养基：NaNO3375 mg/L，KH2PO4175 mg/L，MgSO4·7H2O 75 mg/L，K2HPO475 mg/L，EDTANa250 mg/L，KOH 31 mg/L，NaCl 25 mg/L，CaCl2·2H2O 25 mg/L，H3BO311.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.82 mg/L，MnCl2·4H2O 1.44 mg/L，Na2MoO41.79 mg/L，CuSO4·5H2O 1.57 mg/L，Co(NO3)2·6H2O 0.49 mg/L，FeSO4·7H2O 4.98 mg/L，H2SO41 mL/L。

LB培养基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂18 g/L。

PDA培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂18 g/L。

1.1.2 仪器与设备

GXZ-300D光照培养箱，HZQ-QG全温振荡器，723N可见分光光度计，LRH-150S恒温恒湿培养箱，XSZ-H光学显微镜，LG16-B台式高速离心机，JY96-II超声波细胞粉碎机，YX280加压灭菌锅，DH-101-0S电热恒温鼓风干燥箱。

1.2 实验方法

1.2.1 无菌栅藻的制备

在100 mL栅藻培养液中加入15 μL硫酸卡霉素(90 μg/mL)与80 μL硫酸庆大霉素(90 μg/mL)，置于光照培养箱内培养3 d(温度25℃，光照强度60 μmol/(m2·s))。离心收集藻细胞(8 500 r/min，10 min)，将藻细胞用无菌水稀释至10-4，涂布在添加2%葡萄糖的BBM固体培养基(NaNO3质量浓度250 mg/L)，置于光照培养箱培养5 d(温度25℃，光照强度60 μmol/(m2·s))。将生长出的单藻落转接至BBM液体培养基内培养制备成种子培养液。

1.2.2 栅藻共生微生物的分离与种类确定

栅藻的共生微生物通过稀释涂布法分离。取0.5 mL栅藻培养液稀释至10-3、10-4、10-5，分别涂布在添加2%葡萄糖的BBM固体培养基，置于光照培养箱培养5 d(温度25℃，光照强度60 μmol/(m2·s))，根据菌落不同的形态特征挑选单菌落，分别转接至LB或PDA培养基内培养。将分离得到的微生物进行显微镜观察与革兰氏染色，确定微生物种类。

1.2.3 促进栅藻生长微生物的筛选

在装有100 mL 1.5N-BBM培养基的锥形瓶中分别接入10 mL无菌栅藻(1.15×107个/mL)和1接种环1.2.2分离的菌体，置于光照培养箱内培养10 d(温度25℃，光照强度60 μmol/(m2·s))，测定生物量和脂类含量。

1.2.4 藻-菌混合培养(M)

细菌接种液的制备：将筛选的细菌接种至LB培养基内，置于恒温摇床培养3 d(温度25℃，摇床速度120 r/min)，细菌发酵液细胞浓度约为2×108个/mL。取4 mL细菌发酵液于8 500 r/min离心10 min，收集细胞，用无菌水洗涤2次，稀释，制备细菌接种液(1×108个/mL)。

混合培养：在100 mL 1.5N-BBM培养基内加入10 mL无菌栅藻(2.5×107个/mL)及不同体积细菌接种液，使接种比例(藻菌细胞浓度比)达到1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，置于光照培养箱内培养10 d(温度25℃，光照强度60 μmol/(m2·s))，测定生物量和脂类含量。

1.2.5 添加NaHCO3培养栅藻(C)

在100 mL 1.5N-BBM培养基中加入10 mL无菌栅藻(2.5×107个/mL)与不同体积NaHCO3溶液(10 g/L，无菌过滤)，使培养液中NaHCO3质量浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L，置于光照培养箱内培养10 d(温度25℃，光照强度60 μmol/(m2·s))，测定生物量和脂类含量。

1.2.6 添加NaHCO3的藻-菌混合培养(MC)

按1.2.4、1.2.5确定的藻菌最佳接种比例和NaHCO3质量浓度进行添加NaHCO3的藻-菌混合培养(MC)，以栅藻单独培养(CK)、藻-菌混合培养(M)、添加NaHCO3培养(C)3种培养方式为对照，置于光照培养箱内培养16 d(温度25℃，光照强度60 μmol/(m2·s))，测定不同培养方式下的生物量和脂类含量。

1.2.7 反应参数测定

1.2.7.1 生物量及细胞生长动力学参数

栅藻生物量(细胞干重，DCW)参照Dong等[13]的方法测定。

细胞生长动力学参数参照文献[26-27]按下式计算。

(1)

(2)

式中：Xn与X0分别为时间tn与t0时的生物量。

1.2.7.2 培养液中硝态氮浓度

硝态氮浓度按Hecht等[28]的方法分析测定。

1.2.7.3 培养液pH

取5 mL栅藻培养液，离心，取上清液用pH计测定。

1.2.7.4 脂类含量、合成动力学参数及脂肪酸组成

脂类含量的测定参照文献[26]方法按下式计算。

(3)

式中：GL为总脂量；V为藻液体积，X为细胞浓度(生物量)。

脂类合成动力学参数参照文献[26-27]按下式计算。

(4)

(5)

式中：X0、Xn与G0、Gn分别为t0与tn时的生物量与脂类含量；r为脂类合成速率。

脂类脂肪酸组成参照文献[26]方法进行分析。

2 结果与讨论

2.1 无菌栅藻

按照1.2.1方法制备无菌栅藻，发现经抗生素处理后稀释的栅藻在平板上形成了无菌的单藻落(见图1)。用接种环将单藻转接至BBM液体培养基中培养得无菌栅藻种子培养液用于后续实验。

图1 栅藻在平板上形成的藻落

2.2 栅藻的共生微生物

按照1.2.2分离栅藻的共生微生物，得到4种微生物，其在平板上形成的菌落见图2。

注：A.黄色菌(B1)；B.红色菌(B2)；C.白色菌(B3)；D.白色菌(F1)。

由图2可看出，分离得到的4种微生物中A、B和C平板菌落为球形，表面及边缘光滑，呈现黄色、红色和白色。显微镜观察和革兰氏染色结果表明：B1、B2和B3细胞呈球状，直径1.0～3.0 μm，革兰氏染色分别为阴性、阳性和阴性，故B1、B2、B3属于细菌。D平板的菌落为疏松的毛绒状，营养菌丝为白色毛绒状，直径为1.5～3.5 μm，孢子囊自孢子梗生出，因此F1属于真菌。将分离的4种微生物分别制备斜面菌种保存。

2.3 促进栅藻生长的微生物

按1.2.3方法将得到的4种微生物接种至无菌栅藻中培养，测定栅藻与不同微生物混合培养的生物量和脂类含量，结果见图3。

注：CK.栅藻单独培养；M1.栅藻与B1混合培养；M2.栅藻与B2混合培养；M3.栅藻与B3混合培养；M4.栅藻与F1混合培养。

由图3可知，实验结束时M1、M4和M2的生物量与脂类含量均高于CK(0.64 g/L，158.4 mg/g)，生物量分别达到1.1、1.0、0.92 g/L，脂类含量分别为215.6、211.2、203.4 mg/g，而M3的生物量与脂类含量(0.61 g/L，153.6 mg/g)则低于CK，说明细菌B3对栅藻的生长有抑制作用，而细菌B1、真菌F1和细菌B2则能促进栅藻的生长。其中细菌B1对栅藻生长的促进效果最显著，因此将细菌B1作为促进栅藻生长的最佳微生物用于进一步的实验。

2.4 栅藻与细菌B1混合培养的最佳接种比例

按照1.2.4方法考察栅藻与细菌B1不同接种比例混合培养的生物量和脂类含量，结果见图4。

图4 栅藻与细菌B1不同接种比例混合培养的生物量和脂类含量

由图4可知：栅藻与细菌B1接种比例为4∶1时，栅藻生物量与脂类含量分别达到最高值(1.18 g/L、217.1 mg/g)，较栅藻单独培养(CK)的生物量(0.7 g/L)与脂类含量(158.3 mg/g)分别提高了68.6%、37.1%。因此，后续实验中均以栅藻与细菌B1的最佳接种比例4∶1进行实验。

2.5 促进栅藻生长的最佳NaHCO3质量浓度

按照1.2.5方法考察栅藻在不同NaHCO3质量浓度条件下的生物量和脂类含量，结果见图5。

图5 栅藻在不同NaHCO3质量浓度条件下的生物量和脂类含量

由图5可知，与栅藻单独培养(0.72 g/L，156.8 mg/g)相比，NaHCO3质量浓度为0.3 g/L时栅藻的生物量与脂类含量均达到最大值(1.38 g/L，225.1 mg/g)，分别提高91.7%和43.6%，因此添加 NaHCO3培养栅藻的最佳NaHCO3质量浓度为0.3 g/L，后续实验中NaHCO3的添加量按此质量浓度进行。

2.6 不同培养方式下反应参数的比较

2.6.1 生物量及生长动力学参数(见图6、表1)

表1 不同培养方式下的细胞生长动力学参数

注：CK.栅藻单独培养；M.栅藻与B1以接种比例4∶1混合培养；C.添加0.3 g/L NaHCO3培养栅藻；MC.0.3 g/L NaHCO3条件下，栅藻与B1以接种比例4∶1混合培养。下同。

由图6可知：CK的生物量初期增长较为缓慢，8 d后上升速度加快，14 d后趋于稳定，最终达到0.82 g/L；M和C的生物量分别从6 d和4 d开始快速上升，培养结束时分别达到1.38 g/L和1.63 g/L；MC的生物量则在3 d即开始迅速上升，至12 d时趋于稳定，培养结束时达到2.42 g/L。与CK相比，M、C和MC的生物量分别提高了68.3%、98.8%和195.1%。

由表1可知，与栅藻单独培养相比，M、C和MC平均比生长速率分别提高了20.0%、26.7%和46.7%，平均生长速率分别提高73.1%、107.7%和211.9%。其中，M促进栅藻生长的机理可能与其他光合自养条件下藻-菌混合培养[29-32]的机理相似，即栅藻光合作用释放的氧气和胞外有机物被细菌吸收代谢后，解除了高浓度氧对栅藻光合作用的抑制并释放出CO2促进了光合作用。而C促进栅藻生长的原因显然是提高了反应体系内CO2的浓度，进而提高了光合作用效率。MC比M和C更能促进栅藻的细胞生长是由于提高了栅藻对NaHCO3的吸收。

2.6.2 培养液中硝态氮质量浓度(见图7)

图7 不同培养方式下培养液中硝态氮质量浓度变化曲线

由图7可知，不同栅藻培养液的硝态氮质量浓度在0～2 d均快速下降，这可能与实验过程中的锥形瓶瓶壁吸附或硝态氮快速进入细胞但未被利用有关。2～4 d硝态氮质量浓度下降缓慢，4 d开始快速下降，其中MC的下降速率最快，至12 d降为0，实验结束时M和C的硝态氮质量浓度分别为11.8 mg/L和0.1 mg/L，CK中硝态氮的下降速率最慢，实验结束时的质量浓度仍然较高，达到33.2 mg/L。MC的硝态氮质量浓度下降速率比M和C以及CK的快，说明MC较M和C促进了栅藻对NaNO3的吸收和利用。

2.6.3 培养液pH(见图8)

由图8可知，CK和M的pH由初始值6.2缓慢上升，10 d后M的pH趋于平稳，而CK的pH继续升高，实验结束时CK和M的pH分别达到8.45和8.14，整个培养过程中M的pH始终比CK的低。C和MC由于添加了NaHCO3,其pH初始值较高，培养过程中C的pH由初始8.2迅速升高至9.9后开始逐渐下降，最终稳定在8.6；MC的pH在4 d时升高至10.1后趋于稳定，8 d后开始缓慢下降，培养结束时达到8.91。藻类光合自养培养过程中，由于藻细胞对生理碱性盐的吸收，导致培养液pH上升。CK的pH缓慢上升主要是由于栅藻对NaNO3的吸收所致，而M的pH低于CK的pH可能是由于细菌B1释放的CO2和分泌的酸性胞外产物造成的。相比之下，C和MC的pH上升是由于栅藻对NaNO3和NaHCO3的吸收导致的，而整个培养过程中MC的pH始终高于C的pH，说明MC比C促进了NaHCO3的吸收和利用。

图8 不同培养方式下培养液pH变化曲线

2.6.4 栅藻脂类含量(见表2)

表2 不同培养方式下的栅藻脂类含量、合成速率和比合成速率

由表2可知，与CK相比，M、C、MC体系栅藻的脂类含量，分别提高了35.6%、41.6%、50.4%，脂类合成速率分别提高了133%、189%、354%，脂类比合成速率分别提高了37.4%、45.5%、54.5%。与CK相比，M和C均能提高反应体系的C/N，MC的NaNO3质量浓度比M和C的低，具有更高的C/N，因而更有利于细胞内碳代谢通量流向脂类合成方向，促进了脂类的合成[33]。MC在12 d时的NaNO3质量浓度已降为0，使藻细胞提前进入“氮饥饿”状态，而高C/N和“氮饥饿”均能促进藻类脂类合成[33-35]。

2.6.5 栅藻脂类的脂肪酸组成(见表3)

由表3可知，栅藻在不同培养方式下的脂类脂肪酸组成基本相同，碳原子数介于14～22之间，其中C16∶0、C18∶1和C18∶2含量较高。与CK相比，M、C、MC C16∶0含量分别提高20.4%、27.9%、38.3%，C18∶1含量分别提高了17.0%、30.9%、47.4%，C18∶2含量提高了7.1%、14.7%、20.5%。

表3 不同培养方式下栅藻的脂肪酸组成及含量 %

3 结 论

藻-菌混合培养和添加NaHCO3培养均能提高栅藻的生物量和脂类含量，而添加NaHCO3的藻-菌混合培养则进一步提高了栅藻的生物量和脂类含量以及脂类组成中C16∶0、C18∶1和C18∶2的含量。因此，添加NaHCO3的藻-菌混合培养比单独的 藻-菌混合培养和添加NaHCO3培养更能促进细胞生长和脂类合成，是一种高效的生物柴油原料生产模式。