中药生地黄对栅藻生物光子辐射的影响*

贾寒，庞靖祥，杨美娜，张玉风，韩金祥△

（1.济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院，山东济南250020；2.山东省医学科学院医药生物技术研究中心，山东济南250062）

1 引 言

任何有生命的物质都会自发的向外辐射光子，这种现象称为生物光子辐射，其波长范围在200～800 nm，强度很弱，大约几到几百个光子/s·cm2，但是它携带着丰富的生命信息，能提供有机体代谢及功能转化的重要信息［1］。大量实验结果表明，生物光子辐射存在于所有的生物系统之中，是一种普遍的生命现象。生物光子辐射对生物系统内部及外界环境的变化具有高度灵敏性，所以，可以通过对生命系统的生物光子辐射的检测和研究，来获得丰富的生命信息，从而了解生命系统内外界环境的微弱变化。

水体中的藻类对污染毒物非常敏感.而且种类繁多.可以生存在不同类型的水体以及水体的不同生境之中，所以其可作为监测水质变化的测试生物［2］。栅藻是淡水中常见的浮游藻类，在水质评价中可作为指示生物，且斜生栅藻等又极易进行大量人工培养，故栅藻常常作为研究水体污染的一种很好的实验材料［3-4］。综上所述，栅藻对其所处的环境非常敏感，在不同的水环境中其生物学行为会有所不同，因而，其生物光子辐射行为也会存在差异。本研究以栅藻为实验对象，利用YPMS-2生物光子测量仪对加入中药生地黄后的栅藻生物光子辐射行为进行探索研究。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 主要仪器设备 光电倍增管（9558QB），样品室，光源装置，高压电源，制冷系统，光子计数器，数据采集卡，UV-2802型紫外可见分光光度计，恒温光照培养箱，灭菌锅，电陶炉，砂锅。

2.1.2 供试生物 栅藻（Scenedesmus sp.）自中国科学院武汉水生生物研究所采购（编号FACHB-933），使用BG11培养基进行培养。

2.2 方法

2.2.1 栅藻的培养 选取生长状态良好且处于对数生长期的栅藻，将其接入灭菌的玻璃三角瓶（500 ml）中，加入BG11培养基，放入恒温培养箱中培养，设定温度为25℃，光照强度为4 000 Lux，光暗比为12∶12 h，每天手工摇瓶2～3次，培养20天，然后进行转接，转接比例为 1∶5（藻液：BG11培养基）［5-6］。按上述方法培养一段时间，选择长势良好的栅藻进行实验。

2.2.2 栅藻浓度的测定 测定藻类生物量的方法一般有光密度测量法、显微直接计数法、叶绿素a含量测定法等，相较之下，光密度法易于操作，测量过程方便快捷，重复性较高，因此本研究选用光密度法测定栅藻浓度。

混匀藻液，用移液枪吸取3 ml置于4 cm×1 cm×1 cm的石英比色杯中，使用紫外可见分光光度计在波长680 nm处测量藻液的吸光度值。通过藻液的吸光度A与细胞密度Y的线性回归方程：C=（A*11.995+0.1502）*106个/ml（R2=0.9766）［7］，根据测得的藻液吸光度值，计算出藻液的浓度。

2.2.3 中药汤剂的制备 头煎：取10 g生地黄，加200 ml水，浸泡半小时，先用武火煎煮，煮沸后改用文火，共煎煮15 min。滤出药渣用于二煎，保留药液。二煎：将头煎的药渣加水200 ml，煎煮20 min，滤出药渣，保留药液。将两次煎煮的药液合并，用滤纸再次过滤并放凉至室温，最终得到生地黄汤剂50 ml。

2.2.4 实验准备 提前2 h打开温湿度控制系统，设定室温为20℃，室内湿度50%。打开YPMS-2生物光子测量仪，设置仪器的工作电压为1252 V，待制冷系统将温度降至-23℃，测量仪器的本底噪声。

2.2.5 测量生地黄汤剂的生物光子辐射 用移液枪吸取3 ml生地黄汤剂置于4 cm×1 cm×1 cm的石英比色杯中，混匀，然后迅速放入样品室，测量其自发发光、延迟发光。

2.2.6 测量BG11培养基与栅藻的生物光子辐射 取3 mlBG11培养基置于石英比色杯中，放入样品室，测量其自发发光及延迟发光。取3 ml藻液置于石英比色杯中，用紫外可见分光光度计测其吸光度，放入样品室中暗适应15 min，测量其自发发光及延迟发光。

2.2.7 测量加入不同体积生地黄的栅藻自发发光 选取长势良好的栅藻，测其吸光度，从中取样11份置于石英比色杯中，每份3 ml，分别加入11个不同体积（0、50、110、170、230、290、350、410、470、530、590 ul）的生地黄汤剂于藻液中，并将其混匀放入样品室中，暗适应15 min，测量其自发发光。

2.2.8 测量加入不同体积生地黄的栅藻延迟发光延迟发光是生物系统受光照射后发生的长时间超微弱发光弛豫的现象，是生物超微弱发的重要组成部分，被认为是反映生物系统内部状态的一种指标［7-8］。选取一瓶长势良好的栅藻，测其吸光度，在该瓶栅藻中取样11次，每次3 ml，分别置于10个石英比色杯中，向每个样品里依次加入生地黄汤剂 0、50、110、170、230、290、350、410、470、530、590 ul，并将其混匀放入样品室中，暗适应15 min，测量其延迟发光。

2.2.9 数据处理分析 将得到的数据输入originpro 2015软件中，分别对以上的实验结果进行分析处理。

3 结果与讨论

3.1 生地黄汤剂与栅藻液的生物光子辐射比较

为了排除生地黄汤剂自身发光对实验结果的影响，因而对生地黄汤剂的生物光子辐射进行测量。依次检测仪器本底噪声、汤剂的自发发光、延迟发光以及藻液的自发发光、延迟发光，由于白光包含全波段光谱，激发对象后产生的延迟发光将包含生物系统的全面信息，因此激发光源选择白光，激发时间为10 s。如图1所示，仪器噪声的平均光子数为11.07个/s，生地黄汤剂自发发光平均光子数为13.22个/s，栅藻自发发光平均光子数为22.9个/s。从图中可以看出，栅藻的自发发光光子数明显高于仪器噪声和生地黄汤剂，而生地黄汤剂的自发发光光子数与噪声相近，因此与栅藻的自发发光相比，生地黄汤剂的自发发光可以忽略不计。

图1 生地黄汤剂与栅藻的自发发光对比Fig 1 Comparison of Radix Rehmannia Decoction and the spontaneous luminescence of Scenedesmus

图2为生地黄汤剂的延迟发光衰减曲线，可以看出其第1 s的延迟发光光子数为59个/s，随后则直接衰减至自发状态（平均光子数为13个/s），呈指数衰减。图3是生地黄与栅藻延迟发光的衰减曲线，通过对比可以发现，与栅藻的延迟发光相比较而言，生地黄的延迟发光几乎可以忽略不计，综上所述，可以排除实验过程中生地黄汤剂自身的生物光子辐射对结果的影响，加入生地黄汤剂的栅藻的生物光子辐射即为其自身的发光。

图2 生地黄汤剂的延迟发光曲线Fig 2 The delayed luminescence curve of Radix Rehmanniae Decoction

图3 生地黄汤剂与栅藻的延迟发光对比Fig 3 Comparison of delayed luminescence of Radix Rehmannia Decoction and Scenedesmus

3.2 BG11培养基与栅藻液的生物光子辐射比较

BG11培养基是一种无菌水溶液，主要由无机盐NaNO3、K2HPO4、MgSO4、CaCl2、ZnSO4等组成，为了排除培养基自身发光对实验结果的影响，分别测量了BG11培养基的自发发光及栅藻的自发发光，结果见图4。由图中可以看出，BG11培养基的自发发光光子数与噪声的光子数非常相近，而藻液的自发发光光子数明显高于前二者。通过计算，仪器噪声的平均光子数为11.07，BG11培养基的自发发光平均光子数为11.91，藻液的自发发光平均光子数为22.9，前二者的光子数近似相等，因此培养基的自发发光可以忽略不计，藻液的自发发光即为栅藻本身的自发发光。

图4 BG11培养基与栅藻的自发发光对比Fig 4 Comparison of spontaneous emission of BG11 medium and Scenedesmus

图5为BG11培养基的延迟发光衰减曲线，其光子数由50多个在1 s后直接衰减至自发状态，延迟发光曲线呈指数衰减。通过培养基与藻液延迟发光曲线的对比（见图6），可以发现与栅藻的延迟发光相比，培养基的延迟发光几乎可以忽略不计，综上所述，可以排除实验过程中BG11培养基自身的生物光子辐射对栅藻的影响，认为藻液的生物光子辐射即为栅藻本身的生物光子辐射。

图5 BG11培养基的延迟发光曲线Fig 5 Delayed luminescence curve of BG11 medium

图6 BG11培养基与栅藻的延迟发光对比Fig 6 Comparison of delayed luminescence between BG11 medium and Scenedesmus

3.3 加入不同体积生地黄汤剂对栅藻自发发光的影响

选取对数生长期的栅藻，测其吸光度A=1.27，根据公式 C=（A×11.995+0.1502）×106个/ml（R2=0.9766）算出藻液的浓度为1.5×107个/ml，然后取11个样，每个3 ml，分别向其中加入不同体积的生地黄汤剂，依次测量栅藻的自发发光，计算其平均光子数，结果见表1。仪器噪声10.9，藻液的自发平均光子数为22.9，随着加入生地黄体积的增加，其自发平均光子数的变化趋势是先增大后减小，最高值在350 ul处，光子数为42.5个/s，见图7。当加入汤剂的体积小于350 ul时，汤剂的加入体积与栅藻的自发光子数的关系呈正相关，将公式y=a+b×x（1）输入originpro软件中，把测得的栅藻自发发光数据与理论表达式（1）进行最佳线性拟合，得到方程 y=27.35714+0.76113×x，R2=0.971，拟合的两个参数a=27.35714，b=0.76113，拟合关联度高达97.1%，见图8。所以说在一定范围内，生地黄的加入体积与栅藻自发发光平均强度呈较好的线性关系。生地黄为一种常用中药，性味甘寒，归心、肝、肾三经，功效：清热凉血，养阴生津。根据以上数据分析可得，中药生地黄可以使栅藻的自发发光呈现一种规律性的变化，并且在一定范围内二者会表现出较好的线性关系。

表1 不同体积的生地黄汤剂对应的栅藻的自发发光平均光子数Table 1 The average photon of spontaneous emission in different volume of the Radix Rehmannia Decoction corresponding Scenedesmus

图7 随着生地黄汤剂体积增大的栅藻的自发发光平均强度Fig 7 With the volume increase of Radix Rehmannia Decoction，the average intensity of spontaneous luminescence of Scenedesmus

图8 加入的生地黄体积（＜=350ul）与栅藻自发发光平均强度的线性拟合Fig 8 Linear fitting between the volume（＜=350ul）of Radix Rehmannia Decoction and the average intensity of spontaneous luminescence of Scenedesmus

3.4 加入不同体积生地黄汤剂对栅藻延迟发光的影响

图9为栅藻延迟发光曲线的拟合，本文运用“顾参数”模型对栅藻的延迟发光进行分析，该参数的函数表达式为：I（t）=——（1），利用公式（1）对栅藻延迟发光曲线进行拟合，可以得出A、B、C三个参数，即顾参数，然后再根据公式 I（0）=A×csch2C——（2）算出栅藻延迟发光的初始强度，结果见表2（藻液自身的延迟发光实测/计算初始强度分别为33165，30965）。随着生地黄汤剂体积的增加，实测初始强度和计算初始强度均是先增大后减小，最高值在350 ul处，说明中药生地黄对栅藻的延迟发光具有明显的影响。栅藻延迟发光呈双曲线衰减规律，说明生物系统内的各个激发态分子之间是相互偶联的，它们可能通过生物系统内存在的电磁场互相联系，而这正是相干场的重要特征［9-10］。电磁辐射相干性：一部分自发的和光诱导的生物超弱发光的光子（量子），起源于生物系统内一个高度相干的电磁场，这种相干电磁场很可能是活组织内通讯联络的基础［11-13］，而恰恰可能是生物光子扮演着生物体内一种新型通讯信使的角色［14］。

图9 栅藻的延迟发光曲线Fig 9 The Delay luminescence curve of the Scenedesmus

表2 不同体积的生地黄对应的栅藻的延迟发光初始强度Table 2 The initial intensity of delayed luminescence of Scenedesmus corresponding to different volumes of Radix Rehmannia Decoction

4 结论

（1）通过对仪器噪声、生地黄汤剂与栅藻液生物光子辐射的对比分析，可以得出结论，生地黄汤剂自身并无生物光子辐射，这就排除了汤剂发光对实验结果的影响。

（2）由BG11培养基与栅藻液的生物光子辐射的比较分析可知，培养基几乎无发光，栅藻的生物光子辐射能力较强，其延迟发光的双曲线规律为生物光子辐射的相干性理论提供了有力证据，这说明以栅藻作为指示剂具有可行性。

（3）根据实验结果可以看出生地黄汤剂会对栅藻的生物光子辐射行为产生明显的影响，其对栅藻自发发光平均强度与延迟发光初始强度的影响趋势均表现为先增大后减小，发光强度的最高值在350 ul处。这说明中药生地黄本身的固有性质（即药性）会改变栅藻的生物学行为，从而表现为栅藻生物光子辐射行为的变化。前期本课题组基于生物光子相干理论提出中药药性量子假说［15］，并认为利用生物光子检测技术，通过检测不同药性中药生物光子辐射行为的差异，可从整体上获得表征中药药性的生物光子量化指标。栅藻作为一种常用的水质指示生物，它可以对其周围液体环境所发生的变化做出灵敏的反应，本实验研究结果显示不同体积的中药生地黄汤剂对栅藻生物发光行为影响不同，具体反映在栅藻生物光子辐射行为自发强度和延迟发光初始强度的变化上，这为后续利用栅藻生物光子辐射行为的差异来区分中药药性提供了实验支持。

综上所述，可以发现利用栅藻的生物光子辐射来区分中药药性具有较好的可行性。为栅藻作为中药药性的指示剂奠定了基础。同时，也为将来相关课题的研究提供了依据。