黄芪桂枝五物汤对糖尿病大鼠周围神经组织Trx及Txnip表达的影响

张文娓，韩玉生，王超，范越，田明

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

黄芪桂枝五物汤对糖尿病大鼠周围神经组织Trx及Txnip表达的影响

张文娓，韩玉生，王超，范越*，田明

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：研究黄芪桂枝五物汤对STZ大鼠坐骨神经Trx及Txnip表达的影响，初步探讨黄芪桂枝五物汤治疗糖尿病周围神经病变(DPN)的机制。 方法：将链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠随机分为模型组、给药组，另取正常大鼠为对照组。8周后，采用Western blot法及实时荧光定量PCR法测定大鼠坐骨神经中Trx 与Txnip表达。 结果：Western bolt法显示模型组大鼠坐骨神经Txnip表达明显高于对照组(P<0.01)，给药组低于模型组(P<0.01)。实时定量PCR法显示模型组大鼠坐骨神经Txnip表达明显高于对照组(P<0.01)，给药组低于模型组(P<0.01)但高于对照组。而大鼠坐骨神经Trx表达中模型组明显低于对照组(P<0.01)，给药组高于模型组(P<0.01)但低于对照组。结论：DPN大鼠坐骨神经存在Txnip系统异常，黄芪桂枝五物汤治疗糖尿病周围神经病变，其作用机制与抑制Txnip表达，提高Trx表达有关。

黄芪桂枝五物汤；糖尿病周围神经病变；Trx；Txnip

糖尿病周围神经病变(Diabetic Peripheral Neuropathy，DPN)是糖尿病并发症中最普遍的一种，其发病率高，甚者致残，病机复杂，因素繁多[1-3]。目前发病机制还没有明确，其中参与影响因素众多。黄芪桂枝五物汤是临床治疗DPN常用基础方之一[4-6]，疗效确切，效果显著，为进一步探究其作用效果及作用机制，本文将做相关的实验研究。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠(黑龙江中医药大学GLP；合格证号：SCXK黑2008004)。

1.2 药物及试剂

黄芪桂枝五物汤，含生药量1 g/mL，(黑龙江中医药大学实验中心制)；链脲佐菌素(Sigma公司)；NC膜(美国密理博公司)；Ecl Western blot检测试剂盒，琼脂糖(电泳级)(上海百赛生物技术有限公司)；绿如蓝低毒核酸染料(中国天泽基因工程有限公司)；引物合成(中国上海捷瑞生物工程有限公司)；TaKaRa反转录试剂盒、TaKaRa DL2,000 DNA Marker(中国大连宝生物工程有限公司)；兔抗Txnip多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；山羊抗兔IgG-HRP二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；BlueRanger预染蛋白质相对分子质量标准物质，蛋白质相对分子质量标准物质(美国生物农药公司)；SDS-PAGE 胶电泳所有试剂(美国Amresco公司)；其余试剂均为分析纯。

1.3 主要仪器

普通PCR仪(PTC-100，美国MJ)；荧光定量PCR仪(ABI-7500，美国AB)；凝胶成像系统(GelDoc-It，美国UVP)；酸度计(310P-02，美国Orion)；电子分析天平(AB204-N，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；-80℃低温冰箱(MDF-382E，日本三洋)；紫外分光光度计(UV-1601PC，日本岛津)；超纯水仪(Milli-Q，美国密理博)；制冰机(Grant,XB70，美国)；高速低温离心机(Sigma,3-18K，德国)；恒压恒流电泳仪(DYY-6C,北京六一仪器厂)；ThermoForma725(美国Forma公司)。

2 实验方法

2.1 动物造模与分组

选取8周健康雄性SD大鼠80只，体质量200～220 g，随机分成空白组(20只)及模型组(60只)。模型组大鼠给予链脲佐菌素(STZ；用0.1 mol/mL柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液配制)按70 mg/kg剂量进行腹腔注射，经过72 h测定模型组大鼠空腹血糖，若测得的血糖值≥16.7 mmol/L，即造模成功，可作为糖尿病模型大鼠。空白组大鼠按70 mg/kg剂量注射柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。将空白组和模型组大鼠分笼饲养10周，自由饮水、进食。10周后检测模型组大鼠坐骨神经传导速度，并与10周前检测结果进行比较，若神经传导速度减慢、轴突萎缩、结周脱髓鞘者即为DPN模型，再将DPN模型大鼠随机等分成3组，分别为黄芪桂枝五物汤组(HQG)、弥可保组(MKB)及模型组。HQG组按生药5 g/(kg·d)剂量灌胃给药；MKB组按175 μg/(kg·d)剂量灌胃给药，空白组及模型组按5 g/(kg·d)剂量给予蒸馏水，连续给药 8周，8周后取材检测指标。

2.2 Western blot法检测Txnip蛋白表达

称取100 mg坐骨神经组织充分研磨，加入新鲜配制的蛋白裂解液(RIPA)1 000 μL，并将混合液置匀浆器中进行匀浆，再于4℃下，12 000 r/min离心10 min，取上清液，按照BCA蛋白定量试剂盒说明书中步骤测定总蛋白含量。再称取20 μg蛋白，与蛋白上样缓冲液以5∶1混匀，沸水浴5 min，使蛋白变性，12 000 r/min离心5 min，取上清液，进行SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白质，再将蛋白质从凝胶以300 mA转移到NC膜，经过60 min,再用5%脱脂奶粉进行封闭处理。NC膜上转印蛋白与一抗结合发生免疫反应后，再加入二抗，在室温下孵育1 h。加入酶标抗体，5 min后观察，可见清晰的蛋白条带，至蛋白条带颜色深度达到要求后，用去离子水洗涤终止反应。采用电泳凝胶成像分析系统对蛋白条带进行灰度面积扫描，计算目的蛋白条带与内参条带的灰度值，二者的比值即为目的蛋白的相对表达量。

2.3 实时荧光定量PCR测定Txnip mRNA及Trx mRNA的表达

称取100 mg组织，按照RNA提取试剂盒说明书中步骤提取总RNA，并采用紫外分光光度计测定260 nm处的光密度值计算RNA的浓度，测定260 nm及280 nm处的吸收值，计算RNA的纯度。配好1.2%甲醛变性胶电泳缓冲液中预电泳15 min，取1 μL总RNA在电压120 V下电泳20 min，检测RNA的完整性。将RNA反转录成cDNA，利用Primer 5.0软件设计引物并进行扩增。以β-actin为内参基因进行实时定量PCR测定，引物的序列为:

Txnip扩增引物:上游5′-ATCATGGCGTGGCAAGAGTC-3′，下游5′-TTTCT TGGAGCCAGGGACAC-3′.Trx 上游引物为 5′-GTCTTTACCATACAAA AAGAT AC-3′，下游引物为5′-CCCTGTGTTAGGAGATAG-3′。β-actin扩增引物:上游5′-GG TCGGAGTGAACGGATTTG-3′，下游5′-CCTTGACTGTGCCGTGGAAT-3′.Real-time PCR扩增:c-DNA 2.0 μL，SYBR PremixEx Taq TM (2) 10 μL，PCR Forward Primer (10 μM)0. 4 μL，PCR Reverse Primer(10 μM) 0.4 μL，ROX Reference DyeII(50) 0.4 μL，灭菌蒸馏水6.8 μL。经过预变性95℃ 30 s; 95℃ 5 s，60℃ 34 s共40个循环，完成PCR扩增程序。此过程中收集荧光信号，待反应结束后，采用荧光定量分析仪对数据进行处理。测定PCR扩增时每份样品的Ct值，利用内参基因校正，计算样品相对表达量。

3 结果

3.1 各组大鼠坐骨神经Txnip表达的变化

Western bolt法显示模型组大鼠坐骨神经Txnip表达明显高于对照组(P<0.01)，给药组低于模型组(P<0.01)，其中HQG组较MKB组低，但无显著性差别。结果见表1。

表1 各组大鼠坐骨神经Txnip蛋白表达±s)

注：与正常组比较,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.01

实时定量PCR法显示模型组大鼠坐骨神经Txnip mRNA表达明显高于对照组(P<0.01)，给药组低于模型组(P<0.01)但高于对照组。结果见表2。

表2 各组大鼠坐骨神经Txnip基因表达±s)

注：与正常组比较,*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01

3.2 各组大鼠坐骨神经Trx表达的变化

实时定量PCR法显示模型组大鼠坐骨神经Trx mRNA表达明显低于对照组(P<0.01)，给药组高于模型组(P<0.01)但低于对照组，其中HQG组较MKB组低，但无显著性差别。结果见表3。

表3 各组大鼠坐骨神经Trx基因表达±s)

注：与正常组比较,**P<0.01;与模型组比较,##P<0.01

4 讨论

糖尿病是一种终身性、全身性的慢性非传染性疾病，糖尿病周围神经病变(DPN)是最常见的慢性并发症之一，临床表现主要为便秘、腹胀、肢体麻木、神经病理性疼痛、感觉异常等，其发病率高，致残率也随之增加，目前已成为全球不可忽视的疾病问题[7-8]。对于DPN的发病机制至今尚未完全明确，现有研究表明其发病受细胞生长因子，遗传因素，糖代谢异常及自身免疫功能等多方面因素影响，其中抗氧化剂硫氧还蛋白(Trx)及其内源性抑制剂硫氧还蛋白反应蛋白(Txnip)是DPN发病机制的重要影响因素[9-10]。

硫氧还原蛋白(thioredoxin ,Trx)系统是机体一种对抗氧化应激，维持氧化还原反应的平衡系统，可抑制细胞凋亡。硫氧还蛋白相互作用蛋白(Txnip)是Trx 的生理抑制剂，能下调Trx表达。Txnip过表达，抑制Trx的活性，抑制细胞生长，诱导细胞凋亡[11]。

黄芪桂枝五物汤组成为黄芪、桂枝、白芍、生姜、大枣，具有益气通络、和血通痹之功，是临床治疗DPN常用方剂[12]，具有较好疗效，改善临床症状。本实验黄芪桂枝五物汤可明显降低糖尿病大鼠Txnip表达，提高Trx表达，进一步阐明黄芪桂枝五物汤治疗有效DPN的重要机制与硫氧还蛋白氧化应激反应有关。

[1] Laslie Rd． United Kingdorn Prospective． Diabeters study( UKPDS) ． WHAT now or so what? [J]．Diabetes Metab ResRev，2003，15:65．

[2] 陈伊，刘双岭，孔妍,等.神经传导速度检测对糖尿病周围神经病中医辨证的临床应用价值[J].中医药学报,2015,43(2):127-129.

[3] 李崖雪,闫建华,王丰,等.针刺六经原穴(阴经输穴)治疗糖尿病周围神经病变患者的临床疗效观察[J].中医药学报,2015,43(5):24-26.

[4] 高岑，宋俊生，薛晓焕,等．黄芪桂枝五物汤与西药治疗糖尿病周围神经病变疗效比较的系统评价[J]．辽宁中医杂志，2012，39(6):993-994．

[5] 王红,韩兆莹,吕佳奇,等.黄芪桂枝五物汤临床应用研究[J].中医药学报，2014,42(1):105-107.

[6] 李冀,孙新雨,毕珺辉.黄芪桂枝五物汤的临证应用及实验研究进展[J].中医药学报，2014,42(5):108-111.

[7] 潘立民，孙素芹，叶婷.穴位贴敷治疗糖尿病周围神经病变的疗效研究[J].中医药信息,2016,33(3):96-99.

[8] 李芊绵，王超，范越.黄芪桂枝五物汤对糖尿病周围神经病变大鼠NGF mRNA和VEGF mRNA 表达的影响[J].中医药信息,2016,33(5):42-44.

[9] 高海波，李裕.明硫氧还蛋白和硫氧还蛋白相互作用蛋白与糖尿病及其并发症关系的研究进展[J].国外医学·老年医学分册，2008,29(6)：248-252.

[10] 栗明，刘春燕，丁常宏,等.乌芪通络胶囊对STZ大鼠硫氧还蛋白/硫氧还蛋白反应蛋白(Txnip)系统的影响[J].中医药信息，2013,30(4)：33-36.

[11] Yoshioka J, Schulze PC, Cupesi M, et al.Thioredoxin-interacting protein controls cardiac hypertrophy through regulation of thioredoxin activity[J].Circulation,2004,109(21):2581-6.

[12] 张敬一，史国兵，徐博,等.黄芪桂枝五物汤治疗糖尿病周围神经病变的Meta分析[J].沈阳药科大学学报，2014,31(8)：643-648.

Expressions of Txnip and Trx by Huangqi Guizhi Wuwu Decoction in DPN Rats

ZHANG Wen-wei, HAN Yu-sheng, WANG Chao, FAN Yue, TIAN Ming

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To study the influence of Huangqi Guizhi Wuwu decoction on the expression of Trx and TXnip in the sciatic nerve from diabetic rats induced by STZ, and to discuss the preliminary mechanism of Huangqi Guizhi Wuwu decoction on diabetic peripheral neuropathy (DPN). Methods: Diabetes rats induced by STZ were randomly divided into the model group and the medication group, and the normal rats were taken as the normal control group. The expressions of Txnip and Trx in the sciatic nerve were determined with Western blot and real-time PCR after eight weeks. Results: The expression of Txnip was significantly increased in the model group compared to that of the normal control group (P<0.01), and the medication group could obviously reduce the expression of Txnip compared to the model group by the two methods(P<0.01), but it was still higher than the normal control group. However, the expression of Trx was significantly lower in the model group compared to the normal control group (P<0.01), and it was increased by the medication compared to the model group (P<0.01), but was still lower than the normal control group. Conclusions: There was an abnormity of Txnip in the sciatic nerve of DPN rats, the treatment mechanism of Huangqi Guizhi Wuwu decoction for DPN may be related to the inhibition of Txnip and the enhancement of Trx.

Huangqi Guizhi Wuwu decoction; Diabetic peripheral neuropathy; Trx; Txnip

2016-05-06

2017-04-20

黑龙江省自然科学基金研究项目(H2015047)

张文娓(1982-)，女，硕士，实验师，主要从事中药新药研发与质量标准研究。

*通讯作者：范越(1961-)，女，编审，主要从事中医药文献研究工作。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0057-03