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西洋参对大鼠脑缺血后的心肌Cx43表达的影响

2017-09-03谢海龙刘源于丹王雪婷吕晨王冬雪韩雪燕张淑香

中医药学报 2017年4期
关键词:西洋参脑血管病脑缺血

谢海龙,刘源,于丹,王雪婷,吕晨,王冬雪,韩雪燕,张淑香*

(1.哈尔滨商业大学,黑龙江 哈尔滨 150076;2.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;3.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040)

西洋参对大鼠脑缺血后的心肌Cx43表达的影响

谢海龙1,2,刘源2,于丹2,王雪婷2,吕晨2,王冬雪1,韩雪燕3,张淑香2*

(1.哈尔滨商业大学,黑龙江 哈尔滨 150076;2.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;3.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040)

目的:观察西洋参水煎液预处理对大鼠脑缺血后心律失常的发生和心脏Cx43表达的影响。方法:采用线栓法栓塞大脑中动脉建立大鼠脑缺血模型,术前给西洋参水煎液预处理,监测术后2 h心电图,采用免疫印迹法和组织免疫荧光法检测心室肌Cx43蛋白表达和分布改变。结果:与模型对照组比较,西洋参水煎液预处理组心律失常的出现时间延长,且持续时长明显降低,电镜超微结构可见心肌润盘和缝隙连接损伤减轻,能明显上调心室肌Cx43蛋白表达。结论:西洋参水煎液预处理对大鼠脑缺血后心脏损伤具有明显保护作用。

间隙连接蛋白43;脑缺血;心律失常;西洋参

脑血管病是威胁中老年人健康的常见病,多发病。脑血管病后可引起一系列心电图改变,心肌酶谱异常甚至发生心肌梗死,称为脑心综合症,尤其急性脑血管病发病时心电图变化可高达65%~75%,其中经动态心电图检测的心电图变化阳性率更高,严重影响患者预后,增加死亡率[1-2],因此有效的预防脑血管病后心肌损害具有重要意义。Cx43是心室最主要表达的缝隙连接蛋白,Cx43含量和分布的异常与心律失常有密切关系。因中药成分的多样性往往具有心脑兼治,且副作用小可长期用药的的优势,中药在改善、治疗心脑血管疾病方面一直都有较好的效果。多项报道表明西洋参能有效预防心脑血管事件的发生,西洋参水煎液实验性预处理对心脑综合症后的心律失常的影响未见报道。本实验探讨西洋参水煎液对模型大鼠脑缺血后心律失常的影响以及是否和间隙连接蛋白Cx43有关联,为临床提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

体质量为250~300 g的Wistar健康雄性大鼠,购自长春市亿斯实验动物技术公司,合格证号:20167165。

1.1.2 试剂及主要药材

10%水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司);氯化三苯基四氮(Sigma公司);Mouse-anti-Cx43单抗(北京达科为生物技术有限公司);红外荧光标记的二抗(Jackson公司);BCA蛋白定量试剂盒(BCA Protein Assay Kit,北京博凌科为公司);抗原修复液:0.04% citric acid和0.3% trisodium citrate溶于PBS中,室温保存(哈尔滨市化工试剂厂);穿透液:0.4% TritonX-100和1% BSA溶于PBS中 (上海华舜生物工程有限公司);封闭液:2% goat serum(中杉公司);西洋参(哈药集团世一堂制药厂)。

1.1.3 实验仪器

生物机能实验系统/生物信号采集与分析系统/多道生理记录仪(成都泰盟软件有限公司,BL-420S);低温高速离心机(Bekman公司);超速离心机(Hitachi公司,CS120GXL型);蛋白电泳系统Mini-PROTEAN Tetra(美国BIO-RAD公司);湿转印系统(德国耶拿分析仪器股份公司生命科学Tankblot Eco-Maxi型);冰冻切片机(德国,Leica CM1850 UV型);激光共聚焦显微镜(德国Leica TCS SPE);Odyssey红外荧光扫描成像系统(美国LICOR公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物心电图检测

将心电图正常的Wistar大鼠随机分为3组:正常对照组(normal)、脑缺血对照组(ischemia)、西洋参水煎液组(American ginseng)。西洋参水煎液组预实验时灌胃7天,分两个剂量组3 g/(kg·d)和6 g/(kg·d),电镜结果3 g/(kg·d)无心脏保护作用,故选6 g/(kg·d)给药,灌胃7天,并且术前0.5 h灌胃。脑缺血对照组和西洋参水煎液组选取脑组织TTC染色有明显梗死者。

1.2.2 大鼠模型的制备

采用线栓法复制大鼠右脑中动脉缺血模型,具体操作参见潘国聘[3]实验,包括麻醉、固定、检测心电图、分离动脉、结扎、栓线等操作过程,同时用BL-420S生物机能实验系统持续检测模型鼠心律失常的出现时间及其持续时间。

1.2.3 电镜观察组织病理变化

冰上操作,迅速取出约1 mm3的左心室组织, 4%戊二醛溶液固定心肌组织,放入4℃冰箱保存,在电镜下观察心肌组织病理及超微结构改变。

1.2.4 组织切片确定造模情况

将对照组(脑TTC染色)、模型组和西洋参水煎液组大鼠断头取脑,-80℃保存,冰冻切片,切片厚度约2 mm,配置2% TTC溶液,将切好的脑片放入2% TTC溶液,37℃孵育15 min,观察梗死面积,确定是否造模成功。

1.2.5 蛋白的提取及Western blot定量检测

将置于-80℃冰箱冷冻保存的大鼠左室肌组织取出,与1 mL bufferA溶液混合后用匀浆器进行组织匀浆,匀浆液用低温高速离心机4℃ 3 000×g离心15 min,取上清,4℃ 35 000×g超速离心30 min,弃去上清液, RIPA溶液溶解蛋白。用BCA法对重悬的蛋白溶液进行定量。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离膜蛋白,电泳胶板上样每孔200 μg;转膜:电泳完毕后转膜(PVDF膜);封闭:将PVDF膜在含5%脱脂奶粉的封闭液中37℃封闭1 h;一抗孵育:弃去封闭液,用Mouse-anti-Cx43单克隆抗体(1∶200)孵育2 h,用0.05% Tween-20+PBS洗膜3次,每次15 min;二抗孵育:弃去一抗,用0.05% Tween-20+PBS洗膜3次,每次15 min。再用PBS洗膜一次。将红外荧光标记二抗(Alexa Fluor 700) 用孵育液1∶4000稀释后避光孵育1 h,弃去二抗,用0.05% Tween-20+PBS洗膜3次,每次5 min,再用PBS洗膜3次,每次5 min。应用Odyssey扫描成像系统观察目的蛋白条带的改变。

1.2.6 免疫组织化学

取大鼠心脏,4%多聚甲醛溶液固定心脏,固定时间为16 h;脱水:取出大鼠心脏置于15%的蔗糖溶液中脱水,心脏沉至容器底部后, 取出置于30%蔗糖溶液中继续脱水至心脏再次沉底;冰冻切片,将脑片放入抗原修复液中,加热,当温度达到95℃时,修复约15 min。100 μL穿透液穿透组织,反应时间为1 h,PBS轻轻洗涤3次,每次5 min。加100 μL封闭液,湿盒反应5 h,PBS轻轻洗涤3次,每次5 min。加入100 μL 1∶50稀释的一抗(鼠抗总Cx 43),37℃湿盒反应16 h,PBS轻轻洗涤3次,每次5 min。1∶200稀释二抗(羊抗鼠594),最高转速瞬时离心,加入二抗100 μL,37℃湿盒反应2 h。封片,显微镜下观察下观察目的蛋白的变化。

1.2.7 心电图

监测模型鼠及给药组大鼠的心电图,计算心律失常起始时间、心律失常持续时间。

1.2.8 统计学分析

数据以均值±标准差表示。用Odyssey软件分析蛋白条带,组间用配对t检验,双尾概率以P<0.05差异有统计意义。

2 结果

2.1 心电图分析

将经过西洋参水煎液处理过的大鼠与普通对照组的大鼠进行对比,分析心电图数据可以看出,脑缺血组大鼠心律失常的出现时间为(19.78±3.74)min, 心律失常持续时间为(46.80±4.62)min;西洋参水煎液组心律失常出现时间与脑缺血组相比显著延迟,平均出现时间为(102.34±13.98)min, 心律失常持续时间与脑缺血组相比明显缩短,平均持续时间约为(6.62±1.61)min。心律失常发生率脑缺血组71%,西洋参水煎液组50%。见图1。

图1 西洋参对大鼠大脑中动脉栓塞后心律失常的影响注:与脑缺血组比较,*P<0.05

2.2 心肌细胞缝隙连接电镜下观察结果

由图2可观察到, 正常组大鼠心肌细胞之间连接较致密,肌丝排列整齐,线粒体结构正常。脑缺血后心肌肌丝排列紊乱,缝隙连接异常断裂(图2B箭头所示)。西洋参水煎液组心肌缝隙连接结构比缺血组改善,结构清晰(图2C箭头所示)。

图2 西洋参对大鼠大脑中动脉栓塞后心肌组织缝隙链接的影响注:A:假手术组(×15 000);B:脑缺血2 h(×12 000);C:西洋参(×15 000)

2.3 心肌组织中Cx43表达的变化

脑缺血后心肌Cx43表达减少,西洋参水煎液组有显著提高。见图3。

图3 西洋参对大鼠大脑中动脉栓塞后心肌组织缝隙链接蛋白-43的影响注:与假手术组比较,*P<0.05,与脑缺血组比较,#P<0.05

图3A表示的是western blot 代表图,图3B是统计图(n=4)。

2.4 免疫组织化学实验结果

脑缺血后2 h模型组心肌中Cx43的表达比对照组显著降低,西洋参水煎液组比对照组表达明显提高。见图4。

图4 西洋参对大鼠大脑中动脉栓塞后心肌组织缝隙链接蛋白-43免疫荧光染色的影响注:A:假手术组(×200);B:脑缺血组2 h(×200);C:西洋参组(×200)

3 讨论

心电图分析显示脑缺血后71%出现心律失常,给西洋参水煎液后心律失常发生率减少,心律失常出现时间明显延长,持续时间明显缩短。为探索心律失常的减少是否与Cx43有关,进一步实验验证西洋参水煎液能否改善脑缺血后心肌Cx43的表达。免疫印迹显示西洋参水煎液预处理后心肌Cx43的表达量增加,同时免疫荧光也显示闰盘处Cx43表达得到了恢复。

脑血管病引起心律失常发生率较高,药物治疗效果不确切,尤其是此类疾病死亡率高。据报道心律失常是脑梗死急性期导致患者死亡的重要因素,同时还是脑血管病阶段预后不良的重要警示[4-5],可见寻找有效的治疗药物进行针对性早期干预是降低致死率,改善中远期预后的首要工作。

脑血管病患者伴随心电图异常变化的发病机制并不很清楚,与肾上腺素分泌增加和岛叶损伤有关。脑血管病时交感神经亢进和儿茶酚胺分泌的增多[6],高浓度的儿茶酚胺可引起早期、晚期后除极,降低室颤闭,升高自律性,触发室性心律失常[7-8],大脑中动脉栓塞可累及岛叶,岛叶是调节心血管功能的重要区域,刺激该区可致心律失常[9]。

文献报道采用大鼠心肌缺血再灌注损伤模型及乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型模拟在体损伤,结果显示:西洋参总皂苷能够有效减轻心肌缺血再灌注造成的损伤,其机理是药物可以抑制内质网过度应激[10]。西洋参总皂苷抗心律失常主要机制是阻滞钙离子通道的作用。同时,总皂苷能够缩短大鼠心肌细胞动作电位时程、减小动作电位最大除极速度,延长心肌细胞有效不应期,总皂苷还具有降低心肌收缩能力[11]。综上推测西洋参水煎液可能对脑缺血后心律失常有预防作用,本实验结果也显示西洋参水煎液能减少心律失常发生率。

近年来缝隙连接在心律失常中的作用备受关注,心肌细胞的闰盘结构含有紧密连接、桥粒连接以及缝隙连接,其中缝隙连接介导心肌细胞与细胞之间电信号及化学信号传递,对于维持心肌细胞的正常节律起到关键的作用[12],Cx43是心室主要表达的缝隙连接蛋白,Cx43表达水平的降低和分布异常,能够导致心肌整体传导的速度减慢,传导的各向异性改变,从而诱发心律失常。实验研究显示,在Cx43基因缺陷小鼠其室内传导速度比正常小鼠减低,更易发生致死性心律失常[13]。本研究表明西洋参水煎液能改善心肌Cx43的表达,与心律失常的好转相一致,也再次说明心律失常与Cx43有密切联系,西洋参水煎液调节Cx43的分子机制有待进一步研究。

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Effect of American Ginseng on Expression of Cx43 in Cerebral Ischemia Rats

XIE Hai-long1,2, LIU Yuan2, YU Dan2, WANG Xue-ting2, LV Chen2,WANG Dong-xue1, HAN Xue-yan3, ZHANG Shu-xiang2

(1.HarbinUniversityofCommerce,Harbin150076,China; 2.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 3.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective: To examine the effects of American ginseng on the expression of myocardium connexin43 (Cx43) and its influence for arrhythmia in cerebral ischemia rats. Methods: The cerebral ischemia models were established by occluding right middle cerebral artery. American ginseng decoction was given as preconditioning to rats before modeling. ECG was monitored after two hours of modeling, and the expression and distribution of Cx43 were detected with Western blot method and immunohistochemistry technique. Results: Preconditioning of American ginseng enhanced the expression of Cx43 in the ventricle after cerebral ischemia. The injury of bridge corpuscle in intercalated disc and gap junction in myocardial tissue were reduced under the electron microscope, and the start time of arrhythmias was delayed and the duration was much shorter in American ginseng group compared to those in the model group. Conclusion: Preconditioning of American ginseng have protective effect for myocardium after acute cerebral ischemia.

Cx43; Cerebral ischemia; Arrhythmia; American ginseng

2016-10-21

2016-11-28

黑龙江中医药大学省部共建重点实验室《北药基础与应用研究重点实验室》开放课题

谢海龙(1980-),男,博士研究生,副研究员,主要从事中药药理学研究。

*通讯作者:张淑香(1973-),女,博士,副研究员,主要从事中药药理与毒理学研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0029-04

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