MicroRNA⁃138在胶质瘤中的表达及其功能研究

王 震，刘 楠，刘 辉，张鹏幸，涂艳阳

（第四军医大学唐都医院实验外科，陕西西安710038）

MicroRNA⁃138在胶质瘤中的表达及其功能研究

王 震，刘 楠，刘 辉，张鹏幸，涂艳阳

（第四军医大学唐都医院实验外科，陕西西安710038）

目的：探讨microRNA⁃138（miR⁃138）调控胶质瘤增殖和迁移能力的机制.方法：利用胶质瘤病例分析miR⁃138与胶质瘤临床病理之间的关系；利用realtime⁃PCR检测胶质瘤细胞U87和U251中miR⁃138的表达；MTT检测miR⁃138对胶质瘤细胞增殖的影响；划痕实验检测miR⁃138对胶质瘤细胞迁移的影响；Western blot检测miR⁃138对hTERT蛋白表达的影响.结果：MiR⁃138的表达水平与胶质瘤临床病理密切相关，胶质瘤患者普遍呈现miR⁃138低表达现象，miR⁃138在胶质瘤细胞U87和U251中的表达低于正常胶质细胞HEB.过表达miR⁃138抑制胶质瘤细胞U87和U251的增殖和迁移能力，同时miR⁃138能够下调hTERT蛋白的表达.结论：MiR⁃138通过下调hTERT蛋白的表达抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移，是新的胶质瘤抑癌因子.

MicroRNA⁃138；胶质瘤；增殖；迁移；hTERT

0 引言

恶性胶质瘤是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，具有发病率、复发率、死亡率高和治愈率低等“三高一低”的特点［1］.手术、放化疗均不易根治，易复发，治愈率较低，患者存活期短.目前，各国科学家为了解胶质瘤的发生发展，寻找诊治手段付出了巨大努力，却始终没有取得突破性进展，恶性胶质瘤仍是医学上未被攻克的一大难题［2－4］.

MicroRNA（miRNA）是一类含量丰富的非蛋白编码（non⁃protein⁃coding）小RNA，可作为负性基因调节器调节多种生物进程.近年来很多报道指出miRNAs调控胶质瘤的多种生物过程，包括胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡、干细胞维持以及应激抵抗性等［5］.miRNAs表达水平的改变能够调控很多基因的表达，既包括原癌基因，也包括肿瘤抑制基因，所以miRNAs既可以作为肿瘤抑制因子，也可以作为原癌基因［6］.miR⁃138家族是肿瘤中重要的调控因子，miR⁃138在多种肿瘤中低表达，对胃癌等肿瘤细胞的增殖和转移起负调控的作用［21］，miR⁃138还可以抑制头颈部鳞状细胞癌的侵袭性并促进其凋亡［18］，说明miR⁃138与肿瘤的发生发展密切相关.因此miR⁃138是肿瘤发生过程中重要的调控因子.目前miR⁃138的研究已涉及多种肿瘤，但其与胶质瘤的相关研究国内尚未见报道.本研究旨在揭示miR⁃138对胶质瘤发生发展的调控及其作用机制.

1 材料和方法

1.1 主要试剂兔抗人hTERT多克隆抗体（Santa Cruz公司），多聚赖氨酸（Sigma公司），SP免疫组化试剂盒（北京中杉公司），miRNA抽提试剂盒（TaKa⁃Ra公司），Trizol试剂（Invitrogen公司），RT试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa公司），iQ5实时PCR检测系统（Bio⁃Rad公司），DU 800型紫外分光光度计（Beckman公司）.

1.2 病例来源收集第四军医大学唐都医院2010～2015年胶质瘤手术切除的85例标本.纳入标准：诊断经病理学检查证实；手术患者术前未行化疗或放疗.所有标本获取均经过伦理委员会审核批准.

1.3 细胞培养人神经胶质瘤细胞系HEB、U251MG和U87MG购自中国科学院细胞细胞库，细胞系真实性均经过短串联重复序列验证.所有细胞均用高糖DMEM（Invitrogen公司，美国），添加10%的胎牛血清（GIBCO公司，美国）、100 U／mL的青霉素（NCPC公司，中国）和100 μg／mL的链霉素（NCPC公司，中国），培养环境为含5%二氧化碳的37°C细胞培养箱.

1.4 RNA提取用1 mL TRIzol裂解50～100 mg临床组织标本；冰上用匀浆器反复研磨50次左右，待组织标本研磨至无明显结块后转移到预先标记好的1.5 mL离心管中；向组织匀浆中加入合适体积的氯仿（TRIzol∶氯仿＝5∶1），混匀后室温静置 5 min，12 000 r／min离心20 min；离心后水相和有机相发生明显分层，小心将上层水相吸出，转移到新的1.5 mL离心管中，加入与水相等体积的异丙醇，剧烈震荡混匀，静置10 min；然后，4℃、12 000 r／min低温离心15 min.离心管底可见少量RNA沉淀；小心移取上清，加1 mL左右的750 mL／L的乙醇，12 000 r／min离心15 min；倒掉上清，将离心管倒置酒精完全挥发，用20 μL DEPC水溶解RNA，震荡混匀溶解产物；将溶解的RNA进行适当的稀释（按1∶10），并用分光光度计进行定量.

1.5 转染将细胞接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，5%CO2、37℃常规传代培养.细胞采用脂质体法转染，按说明书进行操作，将脂质体和miR⁃138 mimics（GCCGGACUAAGUGUUGUGGUCGA）混合后无血清条件下孵育细胞，8 h后换成完全培养基培养.

1.6 qRT⁃PCR通过实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）检测miR⁃138在神经胶质瘤细胞、神经胶质瘤组织和创伤性脑损伤组织中的表达水平.按照试剂盒操作规程使用Trizol（Invitrogen公司，美国）从冻存的组织样品和细胞中抽提总RNA.RNA用不含RNase的DNase处理（罗氏公司，瑞士）.然后使用B caBest RNA PCR试剂盒（TAKAR公司，中国）来合成cDNA.所有引物均由上海生工生物科技有限公司合成，荧光定量PCR使用SYBR底物，用iQ5实时PCR检测系统（Bio⁃Rad公司）检测信号.PCR引物序列为：miR⁃138⁃RT：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA⁃TTCAGTTGAGCGGCCTGAT，U6⁃RT：CGCTTCACGA⁃ATTTGCGTGTCAT，U6⁃F：CTC⁃GCTTCGGCAGCACA，U6⁃RAACGCTTCACGAATTTGCGT，miR⁃138⁃F：ACAC⁃TCCAGCTGGGAGCTGGTGTTG，GAPDH⁃F：ACACCC⁃ACTCCTCCACCTTT，GAPDH⁃R：TTAC⁃TCCTTGGAG⁃GCCATGT.

1.7 MTT实验将1×104个细胞重悬在200 μL培养基中，种到96孔板.处理后，培养基换成200 μL含0.5 mg／mL MTT的DMEM／FBS，37°C孵育4 h.弃掉上清，细胞用200 μL DMSO 37°C裂解10 min.测量490 nm处的OD值.

1.8 Western blotWestern blot实验步骤根据BM Chemiluminescence Western Blotting Kit操作说明进行.制好的蛋白样品，先沸水浴煮5 min，煮完后冰上快速冷却后离心5 min（12 000 r／min），然后上样.然后将胶上的蛋白通过电转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，400 mA、100 min于冰浴中转移.用10 g／L酪蛋白封闭液封闭1 h，一抗4℃冰箱孵育过夜（8 h）；一抗孵育完后，用TBST洗涤PVDF膜2次，用封闭液稀释的二抗（HRP标记的抗兔IgG／HRP标记的抗山羊IgG），孵育PVDF膜1 h（摇床100 r／min，室温）；将PVDF膜用TBST洗涤，用X光片曝光.

1.9 统计学处理采用SPSS17.0统计学软件（SPSS公司，美国）通过单边非配对 t检验对独立样本进行分析.所有统计结果的定量分析均采用标准误（±SEM）进行分析，P＜0.05表示差异有统计学意义.

2 结果

2.1 MiR⁃138与胶质瘤临床病理关系以85例胶质瘤患者miR⁃138相对表达量的平均值1.68为界，将85例病例进行临床病理分析分为miR⁃138低表达组和miR⁃138高表达组.结果发现，在各级别的胶质瘤患者中，miR⁃138低表达患者明显多于高表达患者，并且性别、年龄因素对miR⁃138的表达无显著影响（表1）.

表1 85例胶质瘤患者miR⁃138的表达水平与临床病理特征的关系 ［n（%）］

2.2 MiR⁃138在胶质瘤细胞中低表达明确了miR⁃138的表达水平与临床病理特征的关系之后，需要进一步检测miR⁃138在胶质瘤细胞中的表达情况，因此本研究选取正常人脑胶质细胞株HEB和胶质母细胞瘤细胞系U251和U87作为对象检测分析miR⁃138在胶质瘤细胞中的表达.结果发现，miR⁃138在胶质瘤细胞系U87和U251中的表达水平明显低于HEB胶质细胞（图1），该结果进一步证明miR⁃138在胶质瘤中是低表达的.

图1 MiR⁃138在胶质瘤细胞中的表达

2.3 MiR⁃138过表达抑制胶质瘤细胞增殖MiR⁃138在胶质瘤组织和细胞中低表达，由此推测miR⁃138可能在胶质瘤中具有抑癌基因的功能.因此本研究在 U87和 U251中转染 miR⁃138 mimics过表达miR⁃138，并观察miR⁃138对胶质瘤细胞增殖的影响.MTT实验检测结果发现，miR⁃138过表达对U87（图2）和U251（图3）的增殖均起明显的抑制作用.

图2 MiR⁃138对U87细胞增殖的影响

图3 MiR⁃138对U251细胞增殖的影响

2.4 MiR⁃138影响胶质瘤细胞迁移除了增殖实验，本研究进一步用划痕实验检测miR⁃138对胶质瘤细胞迁移的影响.结果发现，划痕形成24 h后，miR⁃138过表达后的U87和U251细胞的迁移速度明显减慢，即miR⁃138对U87和U251细胞的迁移起抑制作用（图4）.

图4 MiR⁃138对胶质瘤细胞迁移的影响

2.5 MiR⁃138对细胞周期蛋白表达的影响研究表明，在胃癌中，miR⁃138可以下调hTERT蛋白，并且hTERT蛋白被证明与胃癌的发生及恶性程度相关.因此本研究检测了在胶质瘤中miR⁃138对hTERT蛋白表达的影响.结果显示，在U87和U251两种细胞中，相对于正常U87和U251细胞以及阴性对照细胞，转染miR⁃138后hTERT蛋白的表达显著下调（图5），表明在胶质瘤中miR⁃138可能通过调控hTERT蛋白的表达影响胶质瘤细胞的增殖和迁移.

图5 MiR⁃138对hTERT表达的影响

3 讨论

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的、预后较差的原发性恶性肿瘤.由于神经胶质瘤呈侵润性生长，与脑组织无明显分界，难以做到全部切除，仅通过传统手术无法有效治愈，多主张联合治疗，配以化疗和放疗延缓复发和延长生存期.即使给予传统的手术联合放、化疗的综合治疗方法，低级别胶质瘤患者的平均存活时间仅为3～5年，而高级别胶质瘤患者的平均存活时间为1～2年.因此，寻找新的治疗靶点一直是胶质瘤领域的研究热点.

MicroRNA是一种内源性的单链小 RNA（19～25 nt）［7］，无开放阅读框.作为非编码的核苷酸，microRNA在许多重要的生命活动过程和疾病中起至关重要的作用［8］.miRNA通过与3'非翻译区配对在转录水平调节目标基因的表达［9］.microRNA参与细胞增殖、分化、凋亡以及其他重要的生命活动，而上述功能与神经胶质瘤的发生和发展密切相关［10］.例如，miR⁃21，miR⁃7，mir⁃128和miR⁃221／22与胶质瘤的恶性发展［11－12］.有研究［13－17］表明，miR⁃101在患者肿瘤样本和细胞系中表达显著下调，例如肺癌、乳腺癌、喉鳞状细胞癌、胚胎性横纹肌肉瘤和胶质母细胞瘤.miR⁃138还可以抑制头颈部鳞状细胞癌的侵袭性并促进其凋亡，通过下调P⁃糖蛋白、bcl⁃2、多药耐药基因1等逆转多药耐药的白血病细胞.其他研究［18］结果也提示，miR⁃138可以调节肿瘤细胞的生长，在肿瘤发生中起重要调控作用.鉴于miR⁃138在胶质瘤中的功能报道较少，因此研究miR⁃138对胶质瘤发生的影响及调控机理具有十分重要的意义.

已有研究表明，hTERT不但在肿瘤的发生、生长中起重要作用［19］，最近还被证实能促进肿瘤细胞的迁移能力，与肿瘤转移密切相关［20］.hTERT可能是miR⁃138的下游靶基因，在胃癌中，miR⁃138可以下调hTERT蛋白，并且hTERT蛋白被证明与胃癌发生及恶性相关［21］.因此本研究检测了在胶质瘤中 miR⁃138对hTERT蛋白表达的影响.研究［21］表明，miR⁃138在转录后水平抑制 hTERT翻译，miR⁃138表达水平与hTERT的表达成反比.本研究发现，miR⁃138与胶质瘤临床病理关系密切相关，在各级别的胶质瘤患者中，miR⁃138低表达患者明显多于高表达患者，且miR⁃138在胶质瘤细胞中表达下调.过表达miR⁃138能够显著抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移能力，证明miR⁃138在胶质瘤中起到抑癌基因的功能.同时在胶质瘤细胞U87和U251中，miR⁃138能够显著下调hTERT的表达，说明miR⁃138可能是通过下调hTERT蛋白的表达起到抑制胶质瘤细胞生长的作用.综上所述，miR⁃138是一个新的胶质瘤抑癌因子，未来可能成为胶质瘤治疗的新靶点.

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A study of the expression and function of microRNA⁃138 in human glioma

WANG Zhen，LIU Nan，LIU Hui，ZHANG Peng⁃Xing，TU Yan⁃Yang
Department of Experimental Surgery，Tangdu Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an 710038，China

AIM：To study the mechanism of miRNA⁃138（miR⁃138）regulating glioma proliferation and migration.METHODS：The relationship between miR⁃138 and glioma was analyzed.Real⁃time⁃PCR was uaed to detect the expression of miR⁃138 in U87 and U251 glioma cells；MTT was used to detect the effect of miR⁃138 on glioma cell proliferation；Would healing was used to detect the influence of miR⁃138 on glioma cell migration；Western blot was used to test the effect of miR⁃138 on hTERT protein expres⁃sion.RESULTS：The expression of miR⁃138 was closely related to the clinical pathology，and glioma patients exhibited miR⁃138 low expression phenomenon.MiR⁃138 was lower expression in U87 and U251 glioma cells compared with normal glial cell HEB.MiR⁃138 inhibited U87 and U251 cell proliferation and migration.At the same time，miR⁃138 overexpression inhibited the expres⁃sion of hTERT.CONCLUSION：MiR⁃138 inhibits glioma cell proliferation and migration through down⁃regulating the expression of hTERT protein，it may be a new glioma tumor suppression factor.

microRNA⁃138；glioma；proliferation；migration；hTERT

R739.41

A

2095⁃6894（2017）07⁃48⁃04

2017－04－29；接受日期：2017－05－13

国家自然科学基金资助项目（81572983）

王 震.硕士.E⁃mail：wzh⁃2010＠163.com

涂艳阳.博士，副教授，副主任医师.E⁃mail：tu.fmmu＠gmail.com