MicroRNA⁃101通过靶向SOX9抑制人胶质母细胞瘤的增殖、迁移和侵袭

刘 楠，张 磊，6，王 震，成迎端，2，张鹏幸，王 欣，温伟红，杨宏伟，刘 辉，金卫林，张永生，涂艳阳，

（1第四军医大学唐都医院实验外科，陕西 西安710038；2北布伦瑞克医院研究部，新泽西 美国 08902；3哈佛医学院布莱根妇女医院神经外科，波士顿美国02115；4第四军医大学免疫学教研室，陕西西安710032；5上海交通大学电子信息与电子工程学院，薄膜与微细技术教育部重点实验室，仪器科学与工程中心，纳米生物医学与工程研究室，上海 200240；6西安儿童医院矫形外科，陕西西安710003）

·论著·

MicroRNA⁃101通过靶向SOX9抑制人胶质母细胞瘤的增殖、迁移和侵袭

刘 楠1，张 磊1，6，王 震1，成迎端1，2，张鹏幸1，王 欣3，温伟红4，杨宏伟3，刘 辉1，金卫林5，张永生1，涂艳阳1，3

（1第四军医大学唐都医院实验外科，陕西 西安710038；2北布伦瑞克医院研究部，新泽西 美国 08902；3哈佛医学院布莱根妇女医院神经外科，波士顿美国02115；4第四军医大学免疫学教研室，陕西西安710032；5上海交通大学电子信息与电子工程学院，薄膜与微细技术教育部重点实验室，仪器科学与工程中心，纳米生物医学与工程研究室，上海 200240；6西安儿童医院矫形外科，陕西西安710003）

多形性胶质母细胞瘤（GBM）起源于大脑皮质，是最常见的原发性恶性肿瘤.尽管当今的治疗手段不断进步，包括手术、放疗、化疗和光动力治疗等，然而GBM患者的预后情况仍然较差.最近的研究表明，microRNA⁃101（miR⁃101）在人肿瘤中显著下调，并与肿瘤细胞的增殖和肿瘤干细胞的自我更新有关.另外，miR⁃101在神经胶质瘤标本和细胞系中显著下调，但胶质瘤中miR⁃101的这种下调现象的分子机制尚不明确.本研究发现miR⁃101可以通过靶向SOX9在体内和体外抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭.沉默SOX9对胶质瘤细胞的增殖和侵袭影响与miR⁃101类似.qRT⁃PCR和Western blot检测发现在人神经胶质瘤细胞系U251MG和U87MG中miR⁃101与SOX9呈负相关，荧光素酶报告分析发现miR⁃101可以通过靶向SOX9的3'UTR区抑制SOX9的表达.研究结果表明miR⁃101通过靶向抑制SOX9的表达在体内和体外调节人神经胶质瘤的增殖、迁移和侵袭，说明miR⁃101是未来神经胶质瘤治疗的潜在靶标.

miR⁃101；SOX9；侵袭；迁移；增殖

0 引言

神经胶质瘤是最常见的恶性脑瘤，通常来源于神经间质细胞，这些细胞可以形成星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤和少突神经胶质瘤［1］.世界卫生组织WHO分类系统将神经胶质瘤分为四个级别，每个级别包含多种病理亚型［2］.如今，手术、放疗等传统的胶质瘤治疗方法的预后很差［3－7］，导致胶质瘤患者的治愈率低，生存期短.胶质母细胞瘤患者的5年生存率低于5%，平均生存期仅14个月［8］.

胶质母细胞瘤是最高级别的神经胶质瘤，对放疗和化疗的敏感性低，预后差且复发率高［9－11］.当前，胶质母细胞瘤的国际标准治疗是手术切除后采用替莫咗胺（TMZ）同步周期性化疗［12－13］.然而，由于胶质母细胞瘤对放疗和化疗具有强抵抗性，只有30%的患者的平均生存期可以超过2年，其中只有9.8%的患者能达到 5年［14］.理论研究发现，微小 RNA（microRNA，miRNA）能够抑制胶质瘤的生物功能，提高患者存活率.研究也表明，敲除miR⁃21能够抑制胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）的增殖和诱导胶质瘤细胞凋亡［15－16］.这些发现为未来神经胶质瘤的临床治疗提供了新策略.

MicroRNA是一种内源性的单链小RNA（19～25 nt）［17］，没有开放阅读框.作为非编码的核苷酸，microRNA在许多重要的生命活动过程和疾病中起至关重要的作用［18］.microRNA通过与3'非翻译区配对在转录水平调节目标基因的表达［19］.microRNA参与细胞增殖、分化、凋亡以及其他重要的生命活动，而上述功能与神经胶质瘤的发生和发展密切相关［20］.例如，miR⁃21，miR⁃7，mir⁃128和miR⁃221／22与胶质瘤的恶性发展［21－22］.有研究表明，miR⁃101在患者肿瘤样本和细胞系中表达显著下调，例如肺癌［28］、乳腺癌［29］、喉鳞状细胞癌［30］、胚胎性横纹肌肉瘤［31］和胶质母细胞瘤［32］.本研究探讨了miR⁃101在GBM中的功能.数据表明，miR⁃101通过靶向抑制SOX9的表达在体内和体外调节人神经胶质瘤的增殖、迁移和侵袭，同时证明了SOX9对胶质瘤的发生发展至关重要，这些结果阐明了SOX9在胶质瘤中的重要功能，同时表明miR⁃101是胶质瘤治疗的新靶标.

1 材料和方法

1.1 组织标本和细胞培养人神经胶质瘤细胞系U251MG和U87MG于2012年购自中国科学院细胞库，正常胶质细胞系A172、T98和HEB购自北京创联生物科技公司（中国，北京）.细胞系真实性均经过短串联重复序列验证.所有细胞均用高糖DMEM（In⁃vitrogen公司，美国），添加10%的胎牛血清（GIBCO公司，美国）、100单位／毫升的青霉素（NCPC公司，中国）和100 μg／mL的链霉素（NCPC公司，中国），培养环境为含5%二氧化碳的37°C细胞培养箱.人类神经胶质瘤组织标本收集自第四军医大学唐都医院的25例患者.正常脑组织标本取自5位创伤性脑损伤的患者.本研究经过第四军医大学唐都医院研究伦理委员会批准.本研究涉及的所有患者均已签署知情同意书，所有标本均根据伦理和法律标准匿名处理.

1.2 总RNA提取和qRT⁃PCR通过实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）来检测miR⁃101在神经胶质瘤细胞、神经胶质瘤组织和创伤性脑损伤组织中的表达水平.按照试剂盒操作规程使用Trizol（Invitrogen公司，美国）从冻存的组织样品和细胞中抽提总RNA.RNA用不含RNase的DNase处理（罗氏公司，瑞士）.然后使用BcaBest RNA PCR试剂盒（TAKAR公司，中国）合成cDNA.所有引物均由上海生工生物科技有限公司合成，荧光定量PCR使用SYBR底物，用iQ5实时PCR检测系统（Bio⁃Rad公司）检测信号.

1.3 载体构建与慢病毒感染构建miR⁃101过表达的引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，miR⁃101的正向 引 物为：CCTGAATTCATTCTAATTTAAT⁃TCAACTGG；反向引物为：TATGGATCCTCAGCACAA⁃CATGGCTGCAC，酶切位点分别是EcoR I和BamH I.通过EcoR I和BamH I将miR⁃101亚克隆到pCDH1载体上（Promega公司，美国）.用表达miR⁃101的慢病毒以及阴性对照慢病毒（GenePharma公司，上海中国）.感染并用5 μg／L的嘌呤霉素筛选10 d后，收集细胞并提取总RNA进行qRT⁃PCR表达分析.我们还构建了SOX9敲除的稳转细胞系.SOX9的短发卡RNA（shRNA）和阴性对照慢病毒shRNA序列由上海吉玛制药技术有限公司（上海，中国）合成.慢病毒shRNA靶向序列分别是 shSOX9⁃1：GCATCCT⁃TCAATTTCTGTATA，sh⁃SOX9⁃2：CTCCACCTTCAC⁃CTACATGAA.干扰片段亚克隆到LV3慢病毒载体上，慢病毒产品也由上海吉玛制药技术有限公司（上海，中国）合成.利用PCR扩增包含miR⁃101结合序列的野生型SOX9的3'UTR序列为：5'⁃GAATTCT⁃CAGTGGCCAGGCCAACCTTC⁃3'和5'⁃CATATGAAAC⁃TGATCACATAACACAA⁃3'，扩增产物亚克隆到PGL3⁃luc载体上（Promega公司，美国）.将预测的miR⁃101靶向位点GUACUGU突变为GAUGACA.野生型SOX9的引物是5'⁃GAATTCTCAGTGGCCAGGCCAAC⁃CTTC⁃3'和5'⁃CATATGAAACTGATCACATAACACAA⁃3'，突变体的引物是5'⁃ATATTTTTAGTATGATGACAG⁃TATGATTCAT⁃3'和5'⁃ATGAATCATACTGTCATCATA⁃CTAAAAATAT⁃3'.

1.4 MTT实验MTT实验步骤参照之前的报道［23］.将1×104个细胞重悬在200 μL培养基中种到96孔板中.处理后，培养基换成200 μL含0.5 mg／mL MTT的DMEM／FBS，37°C孵育4 h.弃掉上清，细胞用200 μL DMSO 37°C裂解10 min.测量490 nm处的OD值（SpectraMax公司，美国）.

1.5 细胞侵袭和迁移实验用 250 μL无血清DMEM重悬2.5×105个细胞并种在24孔的transwell板的内室（Cornin公司，美国），transwell板预先涂上30 μL的基质胶（BD Biosciences，美国）.transwell板的内室外部加入 600 μL的含 10%胎牛血清的DMEM.细胞在37°C迁移48 h（侵袭实验）［24］.然后，transwell板内室的细胞用棉签擦掉，transwell板室底部的细胞用4%的多聚甲醛（Sigma⁃Aldrich公司）固定并用Hoechst染色.在显微镜下取五个不同的视野观察并计数染色的细胞，每组实验至少重复三次.迁移实验与侵袭实验类似，只是transwell板的内室不要基质胶包被，内室外的培养基为含2.5%胎牛血清的DMEM.细胞迁移时间为8 h.

1.6 划痕实验将细胞种在6孔板上培养至细胞完全汇合，然后用200 μL枪头划出一道均匀的划痕.PBS洗两次去除悬浮细胞，然后用含1%胎牛血清的DMEM培养细胞.分别在0 h，12 h，24 h观察并在白光下拍照（尼康DS⁃5M相机）.

1.7 免疫组织化学染色免疫组织化学（immunohis⁃tochemistry，IHC）中，8 μm的福尔马林固定并用石蜡包被的脑组织切片先去蜡和水化.SOX9抗体（1∶100稀释；Abcam 公司，美国）和 Ki67抗体（1∶100稀释；罗氏公司；瑞士）4°C孵育过夜.一抗孵育完后，洗掉一抗，用生物素标记的二抗（1∶800）室温孵育1 h.用苏木精染细胞核.光学显微镜（1×200）拍照，每组样品至少选五个不同视野用于统计.

1.8 Western blot用高氯化钾裂解缓冲液裂解细胞（10 mmol／L Tris⁃HCl，pH＝8.0，140 mmol／L氯化钠，300 mmol／L氯化钾，1 mmol／L EDTA，0.5%Triton X⁃100和0.5%钠脱氧胆酸盐）.裂解液中添加1%的蛋白酶抑制剂（Roche公司）.用BCA试剂盒测定蛋白浓度（Bio⁃Rad公司）.Western blot的主要过程参照之前的报道［25］.信号采集使用增强型化学发光试剂盒（GE healthcare公司，英国）.

1.9 荧光报告酶实验Hsa⁃miR⁃101载体 （吉玛公司，上海）和 PGL3，PGL3⁃SOX9 3'UTR，PGL3⁃SOX9 3'⁃UTRmut质粒转染进HEK293T细胞.转染24 h后，收集并裂解细胞.采用双荧光素报告酶分析系统检测荧光素酶活性（Promega公司，美国）.

1.10 动物实验所有动物实验均经过第四军医大学唐都医院伦理委员会批准.无胸腺的裸鼠购自第四军医大学（陕西，中国），并在动物房标准条件下饲养.胶质瘤细胞裸鼠移植瘤实验参照之前的报道［26］，分别为miR⁃NC和miR⁃101两组U87MG细胞进行移植.移植前裸鼠用10%水合氯醛麻醉，3.0×106的两组细胞重悬在5 mL PBS中植入两侧来建立裸鼠皮下注射移植瘤模型.每天对裸鼠称重.肿瘤体积通过测量肿瘤的长度（a）和（b）进行计算，肿瘤体积（V）计算公式为：V＝ab2／2［27］.

1.11 统计学分析采用 SPSS17.0统计学软件（SPSS公司，美国）通过单边非配对t检验对独立样本进行统计学分析.所有统计结果的定量分析均采用标准误（±SEM）进行分析，并在图中标注，P＜0.05表示差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 过表达miR⁃101抑制胶质瘤细胞体外的增殖、迁移和侵袭为了检测miR⁃101在胶质瘤中的表达水平，本研究收集了20例临床标本，包括10例四级标本，10例三级标本，10例二级标本，10例一级标本和4例脑损伤的正常大脑组织.数据表明，miR⁃101在胶质瘤组织中的表达水平远低于正常脑组织的表达水平（图1A），同时miR⁃101在U87MG，U251MG，A172和T98等胶质瘤细胞中的表达水平低于HEB细胞（图1B）.为了检测miR⁃101在胶质瘤细胞中的功能，用miR⁃101慢病毒感染U87MG和U251MG细胞.感染miR⁃101慢病毒的U87MG和U251MG细胞能够表达高水平的miR⁃101（图1C）.划痕实验检测miR⁃101对胶质瘤细胞迁徙能力的影响，过表达miR⁃101的U87MG和U251MG胶质瘤细胞的迁徙速度相对于阴性对照明显变慢（图1D，E）.此外，Transwell侵袭实验表明过表达miR⁃101可以显著抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭（图1F～I）.过表达miR⁃101的U87MG细胞侵袭能力只有对照细胞的大约八分之一，而迁移能力也只有对照的五分之二（图1F，G）.过表达miR⁃101的U251MG细胞侵袭能力只有对照细胞的大约九分之一，迁移能力也降到对照的五分之二（图1H，I）.MTT实验检测miR⁃101对胶质瘤细胞增殖的影响（图1J，K），感染后24 h～96 h内，过表达miR⁃101的U87MG和U251MG细胞的增殖速度均显著降低（P＜0.05），说明miR⁃101能显著抑制胶质瘤的增殖.

图1 过表达miR⁃101抑制胶质瘤细胞体外的增殖、迁移和侵袭

2.2 过表达miR⁃101抑制胶质瘤肿瘤的体内生长为了明确miR⁃101在胶质瘤中的功能，本研究进一步检测了过表达miR⁃101对胶质瘤肿瘤体内生长的影响.根据前期报道，本研究选择U87MG细胞进行裸鼠移植肿瘤实验［24］.将3.0×106个miR⁃101⁃U87MG细胞和阴性对照细胞分别裸皮下注射裸鼠身体两侧.注射30 d后，结果显示miR⁃101⁃U87MG细胞形成的肿瘤体积明显小于NC⁃U87MG形成的肿瘤（每组五只裸鼠，P＝2.89×10－3；图2A～C）.免疫组织化学染色结果显示，miR⁃101⁃U87MG细胞形成的肿瘤中Ki67阳性细胞比例明显小于NC⁃U87MG肿瘤（图2D）.因此，miR⁃101在体内体外均能抑制胶质瘤肿瘤的生长.

2.3 MiR⁃101在胶质母细胞瘤中直接靶向SOX9用生物信息学方法预测GBM中miR⁃101的潜在靶标.TargetScan软件分析发现SOX9基因的3'UTR区域包含miR⁃101的结合位点（图3A），并且SOX9在二级三级胶质瘤组织中的表达水平高于正常的大脑组织（图3B）.此外，qRT⁃PCR检测发现裸鼠移植肿瘤中SOX9在miR⁃101⁃U87MG细胞中的表达明显低于NC⁃U87MG细胞.说明SOX9可能是miR⁃101的靶标.为了明确miR⁃101和SOX9的调控关系，我们使用qRT⁃PCR和Western blot比较了miR⁃101或miR⁃control慢病毒感染胶质瘤细胞系中SOX9的表达水平.miR⁃101过表达细胞中SOX9的mRNA水平和蛋白水平都显著下调（图3C～E）.本研究进一步构建了一个SOX9 3'UTR的荧光素酶报告质粒.研究发现转染Luc⁃SOX9⁃UTR的细胞相比于miR⁃101靶向位点突变的SOX9 3'UTR质粒和阴性对照的荧光素酶活性显著降低 （图3C）.以上结果表明在胶质瘤中SOX9是miR⁃101的直接靶标.进一步利用免疫荧光比较了miR⁃101和miR⁃control细胞中SOX9的表达.结果表明，过表达miR⁃101只改变SOX9的表达水平，不改变其定位（图3E）.

图2 过表达miR⁃101抑制胶质瘤肿瘤的体内生长

2.4 SOX9在体内体外的抑癌功能为了进一步验证SOX9和miR⁃101之间的靶向关系，本研究分析了SOX9在胶质瘤中的功能.利用两条shRNA sh⁃SOX9⁃1和sh⁃SOX9⁃2在U87MG和U251MG细胞中沉默SOX9.结果表明，sh⁃hSOX9⁃1的效果更好（图4A，B）.然后利用MTT实验、划痕实验和trans⁃well实验检测SOX9在胶质瘤细胞中的功能.用sh⁃hSOX9⁃1慢病毒感染U87MG和U251MG细胞.MTT实验检测SOX9对U251MG和U87MG细胞增殖的影响.感染后24～96 h，相对于对照组，SOX9敲除细胞的细胞增殖速度显著减慢（P＜0.05，图4C，D）.Trans⁃well检测发现SOX9沉默后U87MG和U251MG细胞迁移和侵袭能力均受到抑制（图4E～H）.划痕实验检测沉默SOX9对细胞迁徙能力的影响（图4I，J），结果发现SOX9⁃KD⁃U251MG细胞SOX9⁃KD⁃U87MG细胞的迁徙能力相对各自对照细胞均显著变慢.这些结果表明SOX9在体外和体内都是胶质瘤细胞增殖的必需因素.

图4 SOX9在体内体外均发挥抑癌功能

3 讨论

神经胶质瘤是大脑最常见的原发性恶性肿瘤.尽管治疗技术不断进步，包括手术、放射治疗、光动力治疗、化疗等，然而恶性神经胶质瘤的预后依旧很差，其高发病率和高死亡率促使人们不断寻找新的治疗策略.microRNA是一种内源性非编码RNA，microRNA可以通过靶向目标基因的3'UTR区在转录后水平抑制基因的表达［33］.在人类许多肿瘤内都发现microRNA的下调现象，如卵巢癌［34］、肺癌［35－36］、肝癌［37］、结肠癌［38－39］和GBM［40］等.microRNA的下调已经成为一个新的恶性肿瘤的特征，所以一些特定的microRNA具有成为肿瘤诊断和预后的生物标志物［41－45］.miR⁃101在几种人类肿瘤中都是下调的.研究表明，miR⁃101能够通过抑制纤维母细胞和肿瘤细胞的相互作用和靶向 CXCL12抑制肺癌细胞的侵袭和增殖［27］.miR⁃101在多种肿瘤中通过与CXCR7［29］，CDK8［30］，EZH2［31，47］和CPEB1［32］相互作用发挥生物功能.在GBM中，研究表明，miR⁃101可以通过靶向人Kruppel家族相关因子6在胶质瘤干细胞中起肿瘤抑制因子的作用［46］.此外，miR⁃101可以逆转胶质瘤细胞中LMO3启动子的高甲基化［48］.总之，miR⁃101是包括恶性神经胶质瘤在内的多种肿瘤的重要调控因子.值得注意的是，研究表明在肝癌中miR⁃101可以直接靶向SOX9，抑制SOX9相关的肿瘤功能，促进改善肝癌的预后［49］.SOX9是一个高机动的转录因子，在胚胎形成、分化、肿瘤发生、侵袭和干细胞自我更新中都扮演重要角色［50－51］.这些研究提示 SOX9可能参与miR⁃101的肿瘤抑制过程.因此本研究分析了胶质瘤中SOX9和miR⁃101的关系.数据表明miR⁃101可以通过直接靶向SOX9抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭.结果还表明，SOX9对于胶质瘤肿瘤发生在体外和体内的增殖必不可少.前期报道指出SOX9受到EGFR［52］，Notch［53］，SHH［54］的调控，同时 SOX9可以调控Akt［55］，Wnt［56］和 BMI1［57］等信号通路.由此得出结论，miR⁃101和SOX9调控轴可以通过调控Akt、BMI1、Wnt信号通路调节恶性胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭（图5）.本研究表明miR⁃101和SOX9是人神经胶质瘤的关键调节因子，并为未来胶质瘤的治疗提供了新的治疗靶点.

图5 miR⁃101通过靶向SOX9抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭模式图

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MicroRNA⁃101 inhibits proliferation，migra⁃tion and invasion of human glioblastoma by targeting SOX9

LIU Nan1，ZHANG Lei1，6，WANG Zhen1，CHENG Ying⁃Duan1，2，ZHANG Peng⁃Xing1，WANG Xin3，WEN Wei⁃Hong4，YANG Hong⁃Wei3，LIU Hui1，JIN Wei⁃Lin5，ZHANG Yong⁃Sheng1，TU Yan⁃Yang1，3
1Department of Experimental Surgery，Tangdu Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an 710038，China；2Department of Research Office，Cipher Ground，North Brunswick，NJ 08902，USA；3Department of Neurosurgery， Brigham and Women's Hospital，Harvard Medical School，Boston，MA 02115，USA；4Department of Immunology，Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China；5Institute of Nano Biomedicine and Engi⁃neering，Department of Instrument Science and Engineering，Key Laboratory for Thin Film and Microfabrication Technology of Ministry of Education，School of Electronic Information and Elec⁃tronic Engineering， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240，China；6Department of Orthopedics，Xi'an Children's Hospital，Xi'an 710003，China

Glioblastoma multiforme（GBM）is the most common primary malignant tumors originating in the brain parenchyma.At present，GBM patients have a poor prognosis despite of the con⁃tinuous progress in therapeutic technologies including surgery，ra⁃diotherapy，photodynamic therapy，and chemotherapy.Recent studies revealed that miR⁃101 was remarkably down⁃regulated in kinds of human cancers and was associated with aggressive tumor cell proliferation and stem cell self⁃renewal.Data also showed that miR⁃101 was down⁃regulated in primary glioma samples and cell lines，but the underlying molecular mechanism of the deregulation of miR⁃101 in glioma remained largely unknown.In this study，we found that miR⁃101 could inhibit the proliferation and invasion of glioma cells both in vitro and in vivo by directly targeting SOX9［sex⁃determining region Y（SRY）⁃box 9 protein］.Silencing of SOX9 exerted similar effects with miR⁃101 overexpression on glio⁃ma cells proliferation and invasion.Quantitative reverse transcrip⁃tion PCR and Western blotting analysis revealed a negative rela⁃tionship between miR⁃101 and SOX9 in human glioma U251MG and U87MG cells，and the luciferase assay indicated that miR⁃101 altered SOX9 expression by directly targeting on 3'UTR.Taken together，our findings suggest that miR⁃101 regulates glio⁃ma proliferation，migration and invasion via directly downregulat⁃ing SOX9 both in vitro and in vivo，and miR⁃101 may be a poten⁃tial therapeutic target for future glioma treatment.

miR⁃101；SOX9；invasion；migration；proliferation

R739.41

A

2095⁃6894（2017）07⁃37⁃07

2017－04－29；接受日期：2017－05－13

国家自然科学基金（81572983）；陕西省社会发展科技攻关项目 （2015SF027）；唐 都 医 院 创 新 发 展 基 金 资 助 项 目（2016JCYJ013）

刘 楠.硕士.研究方向：胶质瘤基因治疗.Tel：029⁃84778169 E⁃mail：liu＿nanabc＠126.com

涂艳阳.博士，副教授，副主任医师.E⁃mail：tu.fmmu＠gmail.com