庆大霉素暴露对小鼠肾脏与耳蜗功能损伤效应的对应关系研究

孙克冰柳柯

1北京大学航天中心医院肾内科

2首都医科大学附属北京友谊医院耳鼻咽喉-头颈外科

·基础研究·

庆大霉素暴露对小鼠肾脏与耳蜗功能损伤效应的对应关系研究

孙克冰1柳柯2

1北京大学航天中心医院肾内科

2首都医科大学附属北京友谊医院耳鼻咽喉-头颈外科

目的观察氨基糖甙类药物庆大霉素进入小鼠肾脏和耳蜗毛细胞在时间和数量上的特点及肾功能和听功能损害情况。方法将18只6周龄的C57小鼠随机分为3组，分别为对照组（contr）、用药后1天组（d1）、用药后7天组（d7），每组6只动物。置备完成的TexasRed标记庆大霉素（GTTR）以100mg/kg浓度腹腔注射小鼠，1次/天，通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记庆大霉素在各组小鼠耳蜗毛细胞和肾脏组织积蓄情况，采用Image-Pro Plus软件测算标本荧光强度值，并进一步估算各标本庆大霉素摄取情况。同时，通过生化检测和听力检测，观察用药后小鼠肾功能和听功能损害情况。结果小鼠标本荧光强度（OD）值测算结果：用药后1天，小鼠肾脏组织中庆大霉素即达到了高水平，P<0.01；与此同时，小鼠耳蜗毛细胞内虽然检测到明显的红色荧光，但是其OD值要明显低于肾脏组织。用药后7天，肾脏组织和耳蜗毛细胞的OD值均比对照组有极为显著的升高（P<0.01）。对小鼠肾功能和听力的检测显示，用药后1天小鼠血液中BUN和Scr水平即有明显升高，表明此时肾功能已受到损害；而用药后1天小鼠ABR阈值和对照组相比却未见显著升高（P>0.05），表明此时听力损害尚未显现。在用药后7天，小鼠BUN、Scr和ABR阈值水平和对照组相比均有显著改变（P<0.01）。结论和肾功能损害相比，庆大霉素对小鼠听觉损害具有时间上的滞后效应，而这种时间上的延迟反应为听力损害的临床干预提供了可能。

庆大霉素标记；TexasRed；小鼠；肾脏功能；听功能；

Supporting grants:Thiswork was supported bythe NationalNatural Science Foundation of China(NSFC;31040038),Beijing NaturalScience Foundation(5122040),thegrants from the China Postdoctoral Science Foundation(201003779,20100470103).

Competing InterestStatements:Theauthorsdeclareno competing interests.

在药物引起的肾功能损害中，由氨基糖苷类药物引起的肾脏毒性发病率仍占有相当比例。氨基糖苷类药物引起的肾损害主要为急性肾小管-间质损坏，是以肾小管坏死、变形为主的肾脏功能下降。由于肾脏功能受到破坏导致肾小球滤过率下降，大量代谢产物储留，从而引起体内出现一系列病理反应，对全身各个器官造成不同的损伤。近年来人们注意到，在氨基糖苷类药物引起的肾功能损害过程中，患者听功能也常伴有不同程度的损害，表明此类药物对肾脏和耳蜗两种器官的损害具有一定的关联性[1,2]。然而，目前尚没有氨基糖苷类药物对上述两种器官损害之间相互关系的报道。本研究中，我们采用带荧光标记的庆大霉素对成年C57小鼠进行腹腔注射，分别在用药后前、用药后1天和7天观察肾脏组织和耳蜗毛细胞内庆大霉素的摄取量，同时检测上述时间点上动物的肾功能和听力水平，从而明确庆大霉素在上述两种器官内的摄取情况以及对器官功能的损害，并比较两者在时间上的前后关系。

1 材料与方法

1.1 动物分组及药物暴露

实验采用鼠龄6周的C57小鼠,雌雄不限，体重分布在15～17g，购自维通利华公司。动物入组要求听力及肾脏功能正常。动物随机分为3组：对照组、用药后1天和7天组。每组各6只，共计18只（36个耳蜗及肾脏器官）。实验组动物采用100mg/ kg剂量庆大霉素腹腔注射，对照组采用相同体积生理盐水腹腔注射。本实验操作和动物使用方案得到首都医科大学动物伦理使用委员会的批准。

1.2 实验标本获取

1.2.1 肾脏组织、尿液、血液标本

分别收集对照组、用药后1天组和7天组动物尿液，在获取肾组织时先于腹主动脉收集血液标本。生理盐水灌流肾脏后取肾组织，保存于-80°C冰箱，4%多聚甲醛固定以制作切片。尿素氮（BUN）检测试剂盒和肌酐（Scr）检测试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司），全自动生化分析仪（美国泰尔康公司）。

1.2.2 耳蜗基底膜制备

颈椎脱臼法处死小鼠，断头后取出颞骨，迅速分离耳蜗，开放圆窗和卵圆窗，用细针在蜗尖钻孔，4%多聚甲醛经圆窗、卵圆窗进行灌流，于4%多聚甲醛中固定过夜。解剖显微镜下于0.1mM PBS液中从底回剥除蜗壳，分离耳蜗基底膜顶回，清除前庭膜及盖膜

1.3 庆大霉素-TexasRed结合物

含有庆大霉素的溶液（庆大霉素干粉购自Sig⁃ma,MO,USA，干粉溶解于100mM K2CO3中，形成终浓度50mg/m l浓度的溶液）与Texas Red（得克萨斯红，购自Molecular Probes,OR,USA）在4°C条件下充分混合反应数日，混合物经过纯化，去除未结合的庆大霉素和Texas Red,得到实验用庆大霉素-Texas Red结合物（GTTR）。在实验中用4.4m l庆大霉素溶液（50mg/m l）和0.6mlTexas Red ester (TR)混合形成最终300：1比例（GT:GTTR）的混合液用于本实验中庆大霉素的荧光标记[3-5]。

1.4 听功能测试

听功能测试采用Wu等人测试方法[6]。对照组和用药后1天组、7天组动物行双耳ABR阈值测试（Click），重复率20次／秒，记录ABR，平均叠加次数1024，扫描时间10ms，滤波带宽80-3000 Hz。记录电极置于颅顶，参考电极置于刺激侧耳垂，地线接鼻尖，耳机距小鼠外耳道口3厘米。

1.5 激光共聚焦显微镜成像

将耳蜗基底膜铺片置于激光共聚焦显微镜（Leica TCSSP2 AOBS，德国）下，60×油浸物镜观察，所选择的蓝色和红色激发光波长分别为488nm和567nm。对所观察区域的内毛细胞从上而下进行扫描，分别对标本的各层图像进行连续观察。本实验中，小鼠耳蜗标本扫描层距为2.0μm，小鼠肾脏切片标本激光共聚焦显微镜观察方法与前述基本相同，肾脏组织切片扫描层距亦设为2.0μm。标本荧光标记强度（OD）计算：本研究采用Image-Pro Plus software包来计算标本荧光强度值[7]。首先测算仪器红色荧光的最大强度值并将该数值设定为1.0[8-10]，之后将测得的各标本数值与该最大强度值比较（标本荧光强度值/荧光强度最大值），得到各组标本荧光强度相对值，本实验中，每个标本均在相同倍数物镜下随机取3个相同大小视野测算其OD值[10]。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠耳蜗毛细胞和肾脏组织摄入庆大霉素的比较

本实验采用红色荧光标记庆大霉素，在小鼠经腹腔注射药物到达肾脏和耳蜗两个器官后，通过激光共聚焦显微镜下可以观察红色荧光的分布和强度，进而可以估算药物进入上述器官的情况。本研究中，对照组耳蜗和肾脏组织中几乎未见红色荧光，而在用药后7天，小鼠耳蜗毛细胞和肾脏组织中均可见较强的荧光（图1）。

图1 庆大霉素在小鼠肾脏组织和耳蜗毛细胞的蓄积情况对比Fig.1 Comparisons of accumulated gentam icin in cochlearhair cellsand renal tissueofmice.图1左上图为对照组小鼠耳蜗毛细胞的庆大霉素荧光标记情况，图中显示几乎没有红色荧光出现，白色箭头指示为内毛细胞，标尺：10um；左下图为用药后7天耳蜗毛细胞荧光标记庆大霉素的情况，可见在外毛细胞、内毛细胞区域有明显的红色荧光出现。右上图为对照组小鼠肾脏组织切片，图片中无红色荧光出现，白箭头指示为肾小管，短箭头指示了肾小管上皮细胞。右下图为小鼠用药7天后的肾脏组织标本，图中显示红色荧光标记的庆大霉素大量积蓄于肾脏组织。Fig.1 Upper left panel shows negative uptake of gentam icin in cochlear hair cells of controlmice.White arrow indicates inner hair cells(IHC),bar:10um;Lower left panel show s a representative image of fluorescent gentamicin accumulated in cochlear hair cells at d7 after treatment.Red fluorescent can be found significantly at all hair cells.Upper right panel shows negative uptake of gentamicin in renal tissue of control m ice,white arrow indicates renal tubule and arrowhead indicates renal tubular epithelial cells,lower right panel shows a dramatic increase of uptake of gentam icin in renal tissue of miceatd7 after treatment.

采用此方法，我们分别获得了对照组、用药后1天和用药后7天各组的OD值，结果发现药物在用药后1天即在肾脏组织中出现较高的积蓄量(P< 0.01)，用药7天后积蓄量进一步升高（表1）。

表1 荧光标记庆大霉素在小鼠肾脏中的蓄积量Table1 Accumulation of fluorescentgentam icin in renal tissue ofmice

我们采样同样方法分别检测小鼠耳蜗毛细胞摄取庆大霉素的情况，结果显示在用药后1天耳蜗毛细胞的OD值也有明显升高，但是荧光强度的均值远远不及相同时间点肾脏组织内的水平，说明药物进入肾脏组织的速度和强度均明显高于耳蜗组织。用药后7天，小鼠耳蜗毛细胞内药物蓄积量显著提升，但是仍不及相同时间点肾脏组织的药物蓄积程度（表2）。

表2 荧光标记庆大霉素在小鼠耳蜗毛细胞区域中摄取量Table2 Uptakeof fluorescentgentamicin in cochlear hair cellsofm ice.

2.2 用药后小鼠肾脏功能与耳蜗功能评估

我们分别检测对照组、用药后1天组和用药后7天组小鼠肾脏功能的血液标本BUN和Scr的水平，结果显示，用药后1天小鼠血液标本中上述指标水平即明显升高，用药后7天，小鼠上述指标进一步升高（表3）。

表3 庆大霉素对小鼠肾功能的影响(mmoL/L)Table 3 Gentam icin induced functionaldisruption of kidneyinmice(mmoL/L)

在使用庆大霉素前后的各时间点我们也检测了小鼠听力水平，结果显示用药后1天小鼠ABR阈值和对照组相比并无显著升高（表4，P>0.05）；用药后第7天，可以检测到ABR阈值的显著增高（表4，P<0.05），本结果说明，和肾功能损害相比，小鼠听功能损害出现的时间相对延迟。

表4 庆大霉素对小鼠听力的影响（Click,dBSPL）Table 4 Gentam icin induced hearing impairment inm ice (Click,dB SPL)

3 讨论

庆大霉素等氨基糖苷类药物是引起肾损害的常见原因之一，然而其毒理作用尚未完全明确。有研究报道，在药物引起的急性肾功能损害中，由氨基糖苷类药物引起的肾脏毒性发病率仍然较高[11]。氨基糖苷类药物引起的肾损害主要为肾小管-间质损坏，以肾小管损害为主。当肾功能受损时，血液中BUN水平升高，如果损害进一步加重，Scr水平也随之上升。这种损害的程度和肾脏组织摄入庆大霉素的速度和量有直接关系[12]。关于庆大霉素的肾脏毒性机制，有研究认为可能通过使组织氧化活性产物增加而引起了肾组织损害[13]。对于庆大霉素损害小鼠听力的机制已有较多研究，目前的研究结果涉及耳蜗内多个部位，包括毛细胞纤毛、毛细胞本身、以及听神经的损害等，在这些损害发生时往往导致了听力的下降[2,14-17]。有研究讨论了这种损伤条件对耳蜗内毛细胞下部传入神经突触的影响，认为这可能是氨基糖苷类抗生素损害听力的另外一个部位[18]。进一步的研究证明耳蜗内毛细胞带状突触更易受到氨基糖类抗生素的影响，进而导致突触可塑性的变化，导致听力受损[19-22]。

本研究结果表明，在使用庆大霉素腹腔注射后第1天，小鼠肾脏组织摄取的标记庆大霉素药物即达到了很高水平。相比较而言，耳蜗内外毛细胞尽管也有明显的庆大霉素积蓄，但是程度上尚不及肾脏组织的水平，这表明庆大霉素对肾脏组织和肾功能的影响具有‘时间早、程度重’的特点。这可能与耳蜗器官和全身血液循环之间存在血迷路屏障结构有关，这种屏障结构的存在延迟和减少了耳毒性药物进入内耳的速度和数量。另一方面，本研究结果同时也说明，在应用庆大霉素后1天，动物耳蜗内外毛细胞就出现了明显的药物蓄积，尽管此时ABR阈值尚未出现有统计学意义的升高，但是听觉感觉神经系统的损害可能已经发生。本研究中，小鼠在药物使用后第7天听力水平显著损害，说明庆大霉素对小鼠听功能的损害在药物使用后存在一个持续增强的过程。本研究中使用的动物为C57小鼠，这种小鼠有年龄相关性听力损失现象[6,17]，但是本研究中小鼠为6周鼠龄的动物，衰老因素尚不能对本研究结果造成影响。

本研究一个显著的特点是同时对庆大霉素进入小鼠肾脏和耳蜗的速度及数量进行了标记和比较，我们发现庆大霉素肾功能损害的时间要先于听功能损害，这似乎可以理解为庆大霉素对小鼠听觉损害有一定的滞后效应，这种时间上的延后期也可能为临床治疗和干预保留了机会。当然，本实验尚未涉及此种条件下听功能保护或治疗的研究，更进一步的研究结果还需要在今后的实验中去探索和挖掘。

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An ExperimentalStudy of Correlations Between Gentam icin Induced Renal Trauma and Hearing Impairment

SUN KeBing1,LIU Ke2
1DeaprtmentofNephrology,AerospaceCenter Hospitalof Beijing
2DepartmentofOtolaryngology,Head and Neck Surgery,Beijing Friendship Hospital,CapitalMedicalUniversity

SUNKeBing,Email:sunkebing1978@163.com;

ObjectiveTo explore time and quantity properties of Texas Red labeling gentam icin entry into renal tissue and cochlear hair cells inm ice,aswellas secondary renal injury and hearing loss.M ethods18 adultC57m ice(6 wksold)were random ly divided into three groups.Two groups

daily intraperitoneal injection of gentamicin labeled w ith Texas Red at 100mg／kg for 1 and 7days,respectively.The third group only received the same volume of 0.9%saline for control.Laser confocalobservations combined w ith Image-Pro Plus softwarewere employed to estimate time and quantity of uptake gentamicin in both renal tissue and cochlear hair cells.Further,BUN,Scr,and auditory brainstem responses(ABR)threshold were examined to estimate the functional state of kidney and cochlea after gentamicin exposure.ResultsSignificant increase of OD value at d1was found in renal tissue compared w ith thatof control (P<0.01);Significant,but lower increase of OD value atd1 was identified in cochlear hair cells compared w ith control(P<0.05);Sim ilar remarkable enhancement of OD were found at d7 in both renal tissue and cochlear hair cells.Moreover,significant increase of BUN and Scrwere detected at d1(P<0.05),however,no significantABR(click)threshold elevation was found at d1 after treatment(P<0.05).Dramatic increases of BUN,Scr,and ABR threshold have been found at d7 compared w ith controls(P<0.01).ConclusionsAm inoglycoside induced hearing impairment showed delay reaction compared w ith am inoglycoside induced rapid injury in renal tissue.The time delaymay provide a possibility of clinical invention foram inoglycoside induced hearing loss.

Labeling Gentamicin;TexasRed;M ice;Renal Function;Hearing Function;

R764

A

1672-2922（2017）03-334-5

2017-04-25审核人：郭维维）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.03.012

国家自然科学基金（31040038）、北京市自然基金（5122040）、中国博士后科学基金（201003779,20100470103）

孙克冰，本科，主治医师，研究方向:肾病的发生机制和干预

孙克冰和柳柯为并列第一作者

孙克冰，Email:sunkebing1978@163.com