P-EGFR、P-ERK和NF-κB在中耳胆脂瘤上皮中的表达和意义

王晓丽谢淑敏王月辉刘伟殷团芳彭安全任基浩

1湖南省妇幼保健院儿童五官科（长沙410008）

2中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科（长沙410008）

3河南科技大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科（洛阳471000）

4中南大学湘雅二医院耳鼻咽喉头颈外科，中南大学耳科研究所（长沙410011）

·基础研究·

P-EGFR、P-ERK和NF-κB在中耳胆脂瘤上皮中的表达和意义

王晓丽1谢淑敏2王月辉3刘伟4殷团芳4彭安全4任基浩4

1湖南省妇幼保健院儿童五官科（长沙410008）

2中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科（长沙410008）

3河南科技大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科（洛阳471000）

4中南大学湘雅二医院耳鼻咽喉头颈外科，中南大学耳科研究所（长沙410011）

目的研究磷酸化表皮生长因子受体（P-EGFR）、磷酸化细胞外信号调节激酶（P-ERK）和细胞核转录因子κB（NF-κB）在中耳胆脂瘤上皮组织中的表达情况，探讨EGFR/ERK/NF-κB信号通路在中耳胆脂瘤发病机制中的作用。方法应用免疫组织化学SP法及Western blot(WB)免疫印迹法检测30例中耳胆脂瘤标本及15例正常外耳道皮肤组织中P-EGFR、P-ERK和NF-κB蛋白的表达。结果（1）P-EGFR蛋白阳性表达主要定位于细胞质和（或）细胞膜，在胆脂瘤组的阳性表达率为63%，明显高于正常外耳道皮肤组的20%（P<0.05）；P-ERK蛋白阳性表达主要定位于细胞质和（或）细胞核，在胆脂瘤组的阳性表达率为70%，明显高于正常外耳道皮肤组的20%（P<0.05）；NF-κB蛋白阳性表达主要定位于细胞核，在胆脂瘤组的阳性表达率为60%，明显高于正常耳道皮肤组的13.3%（P< 0.05）。在30例中耳胆脂瘤组织中，P-EGFR、P-ERK和NF-κB两两之间呈正相关关系（P＜0.05）。（2）Western blot免疫印迹法检测结果显示：中耳胆脂瘤组中P-EGFR、P-ERK和NF-κB的表达量明显高于正常外耳道皮肤组的表达量。结论P-EGFR、P-ERK和NF-κB在中耳胆脂瘤上皮中表达增强，EGFR/ERK/NF-κB信号通路可能在中耳胆脂瘤组织的形成和发展过程中起重要作用。

中耳，胆脂瘤，P-EGFR，P-ERK，NF-κB，EGFR/ERK/NF-κB信号通路

Foundation:Nationalnaturalscience foundation of China(NO:81400457)

Conflictof interest:Theauthorsdeclareno conflictof interestw ith regard to thispublication.

中耳胆脂瘤是耳科常见病，虽为良性病变，却具有侵袭性、破坏性、复发性等特征，发病机制尚不清楚，可能与胆脂瘤上皮细胞的过度增殖、凋亡紊乱等有关[1-3]。随着分子生物技术的发展及应用，细胞因子在胆脂瘤发病机制中的作用逐渐被重视，本文主要探索磷酸化表皮生长因子受体（phospho-epidermal growth factor receptor,P-EG⁃FR）、磷酸化细胞外信号调节激酶（phospho-extra⁃cellular signal-regulated kinase，P-ERK）和细胞核转录因子κB（nuclear transcription factor kappa B, NF-κB）在中耳胆脂瘤上皮组织中的表达情况，探讨EGFR/ERK/NF-κB信号通路在中耳胆脂瘤发病机制中的作用。

表皮生长因子受体（epidermalgrowth factor re⁃ceptor,EGFR）是一种酪氨酸蛋白激酶受体，其细胞外部分与配体结合后可形成二聚体自动磷酸化为P-EGFR，从而激活下游MEK/ERK信号通路，调控NF-κB表达，影响细胞增殖、凋亡、迁移等[4-5]。我们的前期研究显示：EGFR在胆脂瘤上皮组织中处于活化状态[6-7]，我们推测：在中耳胆脂瘤组织中可能存在EGFR/ERK/NF-κB信号通路的激活，从而促进胆脂瘤的发生及发展。因此，我们选取该通路的关键因子P-EGFR、P-ERK和NF-κB，运用免疫组织化学SP法及Western blot(WB)检测其表达，探讨EGFR/ERK/NF-κB信号传导通路在中耳胆脂瘤发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本

收集2009.08~2011.08期间中南大学湘雅二医院耳鼻咽喉头颈外科后天性中耳胆脂瘤标本30例为实验组，外耳道正常皮肤组织标本（取自外耳道口正常皮肤组织）15例为对照组。标本取出后一半行常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色，另一半立即置入液氮，作为WB的实验组织标本。

1.1.2 主要试剂

兔抗人P-EGFR多克隆抗体、鼠抗人P-ERK单克隆抗体、鼠抗人NF-κB单克隆抗体购于Santa Cruz公司，RIPA裂解液购自北京普利莱，ECL发光液购自美国Thermo pierce。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫组织化学实验

步骤如下：烤片、脱蜡、水化、灭活内源性过氧化物酶后，0.01M枸橼酸钾缓冲液高压下抗原修复。山羊血清进行抗原封闭后，孵育一抗（P-EG⁃FR浓度1：200，P-ERK浓度1：50，NF-κB浓度1：200），4℃冰箱内过夜。第二天复温至室温30min，PBS浸泡后孵育二抗10~15min，PBS冲洗后，室温孵育辣根酶标记链霉卵白素10～15min，PBS冲洗。用新鲜配制的二氨基联苯胺（diaminobenzi⁃dine，DAB）显色，显微镜下控制反应时间。冲洗，复染，脱水，透明，封片。已知的阳性切片作为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

阳性标准：P-EGFR细胞质着色为棕黄色者为阳性细胞，P-ERK细胞质和（或）胞核着色为棕黄色者为阳性细胞，NF-κB细胞核着色为棕黄色者为阳性细胞。先按照染色的强度（无着色、微弱、中度、深度棕黄色）依次计为0、1、2、3分，然后在400倍显微镜下进行阅片，根据阳性细胞百分比计分：0%、＜10%、10%~50%、＞50%依次记0、1、2、3分。二者之积：0～2分为阴性（-），≥3分为阳性（+）。

1.2.2 Western blot免疫印迹法

剪取适量组织，用冰预冷的PBS清洗组织，加入RIPA裂解液（已加入蛋白酶抑制剂及蛋白磷酸酶抑制剂）于匀浆器中反复研磨组织直至看不见组织块。置于冰上，蛋白裂解30分钟。移至离心管，12000rpm,4℃，15min,离心；将离心后的上清液转移、保存备用。检测蛋白浓度后，配胶、上样、电泳，浓缩胶电泳电压为80V，分离胶电泳电压为120V，待溴酚蓝电泳至离胶底约1cm时终止电泳。根据marker的指示，分别切出所需分子量蛋白的胶：P-EGFR约170KD，P-ERK1/2约42~44KD,NF-κB约65KD，β-actin约42KD。PVDF膜进行转膜。转膜完毕后，1*TBST洗膜5min，用丽春红染膜，检测蛋白转膜的效率。5%脱脂奶粉封闭1~2小时后，PBS洗膜3次，每次15min。然后用1*TBST将一抗按照一定比例稀释（P-EGFR 1：200，P-ERK 1: 1000，NF-κB 1:1000，β-actin 1:4000），孵育一抗，4℃过夜。第二天摇床30min复温至室温。1*TBST洗3次，每次15min。用1*TBST稀释HRP标记的二抗（稀释比例1：3000），孵育二抗45~60min。孵育结束后，1*TBST洗3次，每次15min。使用ECL化学发光液（Thermo）进行显影，定影液终止显色。底片曝光后扫描，并用quantity one专业灰度分析软件进行分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 16.0软件包进行数据分析，计数资料采用卡方检验，计量资料采用独立样本t检验，Spearman检验分析三蛋白之间的相关性，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学检测各蛋白的表达

中耳胆脂瘤组织及外耳道皮肤组织HE染色如图示（图1，图2）。P-EGFR的阳性表达定位于细胞质和（或）细胞膜，着色为棕黄色。实验组30例胆脂瘤标本中共有19例出现阳性染色（图3），阳性率为63%；对照组15例外耳道上皮组织中有3例染色为微弱棕黄色（图4），阳性率为20%。两组间比较差异有统计学意义（χ2=7.515，P=0.006，P<0.05）（见表1）。

P-ERK的阳性表达主要定位于细胞质，有时亦伴有细胞核着色，主要表达在胆脂瘤上皮和皮肤组织的基底层和基底上细胞层。实验组30例胆脂瘤标本中有21例出现阳性染色（图5），阳性率为70%。对照组15例外耳道上皮组织中有3例染色为微弱棕黄色（图6），阳性率为20%。两组间比较差异有统计学意义（χ2=10.045，P=0.002，P<0.05）（见表1）。

NF-κB活化后主要位于细胞核，以细胞核着棕黄色颗粒为阳性细胞。实验组30例胆脂瘤组织标本中有18例出现胞核着色，主要分布于胆脂瘤上皮基底层和基底上层(图7)，阳性率为60%。对照组15例外耳道上皮组织中仅有2例染色颗粒位于细胞核，其余均为胞质着色（图8），为阴性表达，阳性率为13.3%。两组间比较差异有统计学意义（χ2=8.820，P=0.003，P<0.05）（见表1）。

表1 中耳胆脂瘤组和正常外耳道皮肤组P-EGFR、P-ERK与NF-κB蛋白表达情况的比较Table1 Comparison of theexpression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB between cholesteatoma inm iddleearand normalcanalskin

表2所示为使用Spearman方法检验胆脂瘤组中P-EGFR、P-ERK和NF-κB之间的相互关系的结果，胆脂瘤组中P-EGFR与P-ERK的表达存在正相关（r=0.709,P=0.000,P＜0.05），P-EGFR与NF-κB的表达存在正相关（r=0.508，P=0.004，P＜0.05），P-ERK与NF-κB的表达存在正相关（r= 0.505，P=0.004，P＜0.05）。

2.2 Western blot免疫印迹法检测P-EGFR、P-ERK和NF-κB蛋白的相对表达

将曝光后的底片扫描，并用quantity one专业灰度分析软件进行分析。结果显示：中耳胆脂瘤中P-EGFR、P-ERK和NF-κB蛋白的表达明显高于正常皮肤（图9）。对两组样本的相对灰度值进行独立样本t检验，结果示：胆脂瘤组中P-EGFR的相对表达量为0.8380±0.0431，显著高于正常皮肤组的0.3900±0.1175（t=-3.580，P=0.016,P＜0.05）；胆脂瘤组中P-ERK的相对表达量为0.1660±0.0248，显著高于正常皮肤组的0.0700±0.0138（t=-3.381，P= 0.019,P＜0.05）；胆脂瘤组中NF-κB的相对表达量为0.8200±0.1309，显著高于正常皮肤组的0.3860± 0.0706（t=-2.918，P=0.010,P＜0.05）。

图1 胆脂瘤上皮HE染色（×100）；Fig.1 Hematoxylin-eosin staining of cholesteatoma(×100);

图2 正常外耳道皮肤HE染色（×100）；Fig.2 Hematoxylin-eosin staing of normalskin(×100);

图3 P-EGFR在中耳胆脂瘤上皮中的阳性表达（×200）；Fig.3 The positiveexpression of P-EGFR in cholesteatoma (×200);

图4 P-EGFR在正常外耳道皮肤中的阴性表达（×200）；Fig.4 The negative expression of P-EGFR in normal skin(× 200)

图5 P-ERK在中耳胆脂瘤上皮中的阳性表达（×200）；Fig.5 The postive expression of P-ERK in cholesteatoma(× 200);

图6 P-ERK在正常外耳道皮肤中的阴性表达（×200）；Fig.6 ThenegativeexpressionofP-ERK innormalskin(×200);

图7 NF-κB在中耳胆脂瘤上皮中的阳性表达（×200）；Fig.7 The positive expression of NF-κB in cholesteatoma(× 200);

图8 NF-κB在正常外耳道皮肤中的阴性表达（×200）Fig.8 ThenegativeexpressionofNF-κB innormalskin(×200)

表2 中耳胆脂瘤组中P-EGFR、P-ERK和NF-κB蛋白表达之间的关系Table 2 Relationship of the expression of P-EGFR、P-ERK and NF-κB in cholesteatoma

表3 中耳胆脂瘤组和外耳道皮肤组中P-EGFR、P-ERK和NF-κB蛋白的相对表达量Table 3 Comparison of the relative expression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB between cholesteatoma inm iddle earand normal canalskin

图9 两组标本的WB灰度分析图（S：皮肤C：胆脂瘤）Fig.9 Western blotting analysis of P-EGFR,P-ERK,NF-κB between skin and cholesteatoma(S=skin;C=cholesteatoma)

3 讨论

EGFR是一个约170kDa大小、具有酪氨酸蛋白激酶活性的表皮生长因子受体，由胞外区、跨膜区、胞内区3个部分构成。胞外部分与配体结合后可形成二聚体自动磷酸化为P-EGFR，从而激活下游信号通路，发挥促进细胞增殖、迁移及肿瘤细胞侵袭性等作用[7]。

ERK蛋白属于丝氨酸-苏氨酸激酶亚家族，众多成员中关于ERK1、ERK2的研究目前最多。ERK1/2是Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的重要成分，通过结合细胞表面受体转录因子，由细胞浆转移到细胞核中，调控一些重要蛋白的活性，进而调控细胞周期、细胞的增殖、分化及凋亡等过程[8-10]。

NF-κB是一种重要的转录因子，是一种从B淋巴细胞的细胞核提取物中发现的核蛋白。其家族包括五个成员：p50、p52、p65、c-Rel和RelB，它们可以形成多种同二聚体或者异二聚体复合体，激活后由胞浆转移到胞核，参与多种基因的调控、炎症反应和免疫反应，调节细胞的增殖及转化、抑制凋亡、促进肿瘤发展等[11-12]。

本研究中我们通过免疫组织化学方法发现P-EGFR蛋白阳性表达主要定位于细胞质和（或）细胞膜，在胆脂瘤组的阳性表达率为63%，明显高于正常外耳道皮肤组的20%（P<0.05）；P-ERK蛋白阳性表达主要定位于细胞质和（或）细胞核，在胆脂瘤组的阳性表达率为70%，明显高于正常外耳道皮肤组的20%（P<0.05）；NF-κB蛋白阳性表达主要定位于细胞核，在胆脂瘤组的阳性表达率为60%，明显高于正常耳道皮肤组的13.3%（P<0.05）。Spear⁃man检验结果显示：中耳胆脂瘤中P-EGFR、P-ERK、NF-κB三者的阳性表达两两之间均呈显著正相关关系（P＜0.05）。WB免疫印迹检测从蛋白半定量角度也印证了：中耳胆脂瘤中P-EGFR、P-ERK和NF-κB的表达明显高于外耳道正常皮肤，且两组间有显著的统计学差异（P＜0.05）。EG⁃FR与配体发生特异性结合之后，自身磷酸化转变为P-EGFR而激活，继而激活下游EGFR/ERK/ NF-κB信号通路，发挥促进细胞增殖、分化、迁移、侵袭的作用。我们的前期研究证实EGFR在胆脂瘤上皮组织中处于活化状态[6-7]。Huisman等[13-15]发现P-ERK1/2在胆脂瘤上皮组织中的表达较耳后皮肤明显增强，表达部位主要位于胆脂瘤组织全层细胞核，作者推测胆脂瘤上皮中终末分化紊乱，晚期终末分化停止，角质形成细胞滞留在早期终末分化阶段，导致细胞过度增殖、凋亡抑制，角质堆积。Liu等[16]通过免疫组织化学及WB方法发现胆脂瘤组织中P-ERK的表达较正常皮肤增强，主要位于胆脂瘤上皮全层细胞核。我们通过本研究也再次证实了中耳胆脂瘤组织中P-ERK1/2显著增强，此外，阳性细胞不仅表达在细胞核，细胞质中也有P-ERK1/2的阳性表达。

Miyao等[17]发现在胆脂瘤上皮全层均有NF-κB表达，主要位于细胞核周围，细胞核内却无表达，他们推测：胆脂瘤组织中NF-κB失活、其抗凋亡机制失活，联合caspase-3、caspase-8的促凋亡作用，导致角蛋白堆积，胆脂瘤形成。廖军等[18]发现胆脂瘤上皮组织中上皮全层均有NF-κβ表达，23例均有胞浆染色，且8例胞核亦染色，表达强度显著高于正常外耳道皮肤组织，推测炎症反应在中耳胆脂瘤发病机制中起重要作用，提出抗炎治疗、调控NF-κβ的表达可能作为胆脂瘤非手术治疗的方案。我们通过本研究也证实了中耳胆脂瘤组织中NF-κβ的表达较正常皮肤显著增强，且主要表达在细胞核，我们推测：激活的NF-κβ进入细胞核后与相应的靶基因结合，启动了靶基因的转录和表达，从而在胆脂瘤的形成和发展过程中发挥重要作用。

我们知道：P-ERK是EGFR的下游靶因子，NF-κB是P-ERK的下游靶因子，胆脂瘤角质形成细胞所处微环境中存在大量的表皮生长因子（epi⁃dermal growth factor,EGF）、转化生长因子α（trans⁃forming growth factor alpha,TGF-α）及双调蛋白（amphiregulin,AR）等炎症细胞因子，当它们与EG⁃FR特异性结合之后使后者自身磷酸化为P-EGFR而被激活，然后激活下游靶因子ERK，继而NF-κB被激活，导致细胞内部一系列信号级联反应，促进角质细胞增殖、角质碎屑堆积，从而促进中耳胆脂瘤的发生及发展。由此我们推测：EGFR/ERK/ NF-κB信号通路可能在胆脂瘤组织中处于激活状态，在胆脂瘤的发病机制中起重要作用。

综上所述，P-EGFR、P-ERK、NF-κB在中耳胆脂瘤上皮中的表达显著高于外耳道正常皮肤组，EG⁃FR/ERK/NF-κB信号通路可能参与了胆脂瘤组织的形成和发展，在胆脂瘤的发病机制中起重要作用。

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Expression and Significanceof P-EGFR,P-ERK and NF-κB in M idd le Ear Cholesteatoma Epithelium

WANGXiali1,XIEShumin2,WANGYuehui3,LIUWei4,YINTuanfang4,PENGAnquan4,REN Jihao4
1Hunan ProvincialMaternaland Child Health CareHospital,Departmentof PediatricOphthalmology and Otorhinolaryngology,Changsha,Hunan Province,China(410008).
2DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,TheXiangya Hospital,CentralSouth University,Changsha, Hunan Province,China(410008).
3 DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,FirstAffiliated HospitalofHenan University of Scienceand Technology,Luoyang,Henan Province,China(471000).
4DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,The Second Xiangya Hospital,Central South University,Otology Research InstituteofCentral South University,Changsha,Hunan Province,China(410011).

LIUWei Email:lw-007@163.com

ObjectiveTo study the expression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB inm iddle ear cholesteatoma epithelium,and explore the potential roles of EGFR/ERK/NF-κB signaling transduction pathway in m iddle ear cholesteatomaepithelialhyperplasia.Methods SP immunohistochem icalassay and Western blotwere used to detect the expression and significance of P-EGFR,P-ERK and NF-κB in 30 casesofm iddle ear cholesteatoma tissue samples and 15 casesof normal ear skin specimens.Results(1)Immunohistochem istry showed P-EGFR was expressed in the cytoplasm and/or membrane of epithelialcells.P-EGFRwas positive in 19 of the 30m iddleear cholesteatoma specimens(63%),compared to 3 of the15 specimens(20%)in the controlgroup(P<0.05).P-ERK expression in cholesteatomawasdetected ata higher rate(21/30,70%)than normalexternalear canalskin(3/15,20%）(P<0.05).NF-κB immunoreactivity was detected in thenucleiofepithelialcellsatahigher rate in cholesteatoma(18/30,60%)than the controlgroup(2/15,13.3%)(P<0.05).Inmiddle ear cholesteatoma epithelium,there was a positive correlation between expression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB(P<0.05).(2)Western blotdiscovered that the expression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB in cholesteatomawas significantlymore than theamountof expression in skin.ConclusionsTheexpression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB in m iddleear cholesteatomawassignificantly higher than normalskin.Activation of EGFR/ERK/NF-κB signaling transduction pathwaymay be involved in the information and developmentofmiddleearcholesteatoma.

Cholesteatoma;M iddle Ear;P-EGFR;P-ERK;NF-κB;EGFR/ERK/NF-κB Signaling Transduction Pathway

R764

A

1672-2922（2017）03-339-6

2017-01-09审核人：翟所强）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.03.013

国家自然科学基金（项目批准号：81400457）

王晓丽，硕士研究生，研究方向:耳科学

刘伟，Email:lw-007@163.com