禽大肠杆菌对庆大霉素的耐药性诱导试验

王秀英

（辽宁省铁岭县凡河动物卫生监督所 112600）

1 试验材料

1.1 微生物培养设备

恒温箱、微生物接种用具、微量移液器、营养琼脂、伊红美兰培养基、乳糖胆盐培养基、试管、童氏小管、溴甲酚紫试剂等。

1.2 试验菌种来源

来源于铁岭市种鸡场近期未用药自然发病鸡的病料分离培养，经生化试验和血清学检查确定为致病性大肠杆菌，并在培养基中多次继代培养。

1.3 药敏纸片

自制药敏纸片，每片含硫酸庆大霉素20μg[1]。

2 试验方法和步骤

2.1 试验菌种药敏试验

采用K-B 法在营养琼脂培养基上涂布法接种试验用大肠杆菌，置恒温箱中37℃培养24h，取出观察结果，并进行抑菌敏感性读数。

2.2 确定最小庆大霉素抗菌浓度

根据大肠杆菌的耐药产生机制，通过不断适应抗菌药物环境，进行耐药诱导试验。操作方法如下。

（1）取试管8 支。分别乳糖胆盐肉汤培养。第一支4.9ml，2～9 支4.5ml。

（2）倒置童氏小管，排出气体，滴0.05%溴甲酚紫指示剂2 滴，高压灭菌20min，备用。

（3）第1 支液体培养基中用微量移液器加入10%硫酸庆大霉素100μl，反复吹打混合均匀，即为庆大霉素2mg/ml 有效浓度，吸出500μl，加入第2 支培养基中，混合均匀，再吸出500μl 至第3 管，以此10 倍梯度稀释有效浓度硫酸庆大霉素操作至第7 管，混合均匀，吸出500μl 丢弃不用。第8 去做对照。粘贴标签，标记各试管中硫酸庆大霉素浓度。

（4）用微量移液器无菌操作向每只试管液体培养基中接种大肠杆菌菌液，摇匀。

（5）置恒温箱中37℃培养24h，取出观察结果，观察培养基色泽变化和童氏小管中气体产生量，判定细菌是否生长。

2.3 大肠杆菌耐药性诱导试验

（1）将耐药诱导试验中略微开始生长的试管菌种继续接种同一浓度乳糖胆盐肉汤培养基进行继代培养，无药乳糖胆盐肉汤培养基接种作空白对照。

（2）当大肠杆菌逐渐适应抗菌药物环境生长良好或接近空白对照生长程度时，移接下一个10 倍梯度的庆大霉素乳糖胆盐肉汤培养基中继代培养，同时和空白培养对照。记录继代培养代数。

（3）大肠杆菌在某一浓度庆大霉素中适应，产生耐药，生长良好后，即可移接到下一个10 倍梯度的庆大霉素乳糖胆盐肉汤培养基中，直到无法适应，不再良好生长为止。记录继代培养代数和庆大霉素浓度。

（4）保留末代耐药菌种进行下一步试验，同时将末代菌种用K-B 法在营养琼脂培养基上进行药敏试验和抑菌敏感性读数。

2.4 敏感性恢复试验

（1）末代耐药大肠杆菌菌种移接至无药的乳糖胆盐肉汤培养基中继代培养。每偶数代培养后进行1 次K-B 法药敏试验，分别移接至4lg 和3lg 庆大霉素乳糖胆盐肉汤中培养，记录继代培养代数、生长情况和药敏试验数据。

（2）大肠杆菌对庆大霉素性不断的恢复，至最大数据时停止试验，记录恢复培养代数和最后恢复菌种的药敏试验数据。

3 结果与分析

（1）庆大霉素最低抗菌浓度试验结果表明，在4log10 （以下简写lg）有效浓度时不能完全抑制大肠杆菌，即开始生长，庆大霉素对大肠杆菌最小抑菌浓度（MIC）为0.02μg/ml。

（2）耐药诱导试验中，大肠杆菌在4lg 有效浓度庆大霉素中逐渐适应产生药性，在下一个10 倍梯度的庆大霉素环境中迅速适应，继续产生耐药性，在2log10 有效浓度的庆大霉素环境中无法继续适应，耐药性达到最大程度，耐药性不再增强。大肠杆菌对庆大霉素敏感性明显下降，由高敏变成低敏。

（3）根据耐药诱导试验结果，将2lg 有效浓度的庆大霉素环境中大肠杆菌作为试验菌种进行敏感性恢复试验。大肠杆菌在无药的培养环境中对庆大霉素的敏感性开始缓慢恢复，之后迅速恢复，接近试验前的敏感程度。

（4）在无药环境中对大肠杆菌继代培养进行敏感性恢复结果表明，初期大肠杆菌对庆大霉素的敏感性恢复缓慢，经过一段时间后短时间即迅速恢复对庆大霉素的敏感性，由低敏恢复到高敏程度，几乎接近初始状态。

4 小结

（1）庆大霉素对大肠杆菌最小抑菌浓度（MIC）为0.02μg/ml，在防治用药无效时可检验体内庆大霉素含量，其含量应至少相当于10 倍MIC，即0.2μg/ml 才能达到抗菌目的。

（2）大肠杆菌对庆大霉素容易产生耐药性，一旦对庆大霉素适应，迅速产生耐药性。在无药的情况下能很快恢复对庆大霉素的敏感性。因此，在临床防治中不可长期使用庆大霉素，通常突击性使用一个疗程，以免产生耐药，出现耐药后停止应用氨基糖苷类药物一段时间即可恢复敏感性[2]。长远来看，庆大霉素仍然是治疗大肠杆菌的一种有效药物。