刺梨冻干粉对肾纤维化模型大鼠的影响及干预机制研究

刘铭洁 詹继红 郭银雪 王琮瑞 胡茂蓉

·实验研究·

刺梨冻干粉对肾纤维化模型大鼠的影响及干预机制研究

刘铭洁 詹继红 郭银雪 王琮瑞 胡茂蓉

目的通过观察刺梨冻干粉对单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）模型大鼠肾纤维化及免疫炎症因子的影响，探讨刺梨冻干粉延缓肾纤维化的干预机制。方法将SD雄性大鼠分为4组：假手术组、UUO模型组、氯沙坦钾组和刺梨冻干粉组，前两组均予以蒸馏水，氯沙坦钾、刺梨冻干粉组分别给予氯沙坦钾片（1 mg／100 g）及刺梨冻干粉（300 mg／100 g）灌胃治疗，首次给药后14 d处死大鼠，采集标本，观察各组大鼠肾组织病理改变，应用免疫组织化学法检测α平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actinα－SMA）、Ⅲ型胶原（collagenⅢ，Col－Ⅲ）及蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肾脏组织转化生长因子β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）、核转录因子－κB p65（NF－κB p65）、Toll样受体2（Toll－like receptor，TLR2）蛋白的表达。结果光镜下，假手术组肾组织结构基本正常，无明显炎性细胞浸润，间质无或少许胶原纤维；模型组肾组织结构紊乱，大量炎性细胞浸润，肾间质可见明显的胶原纤维沉积，氯沙坦钾、刺梨冻干粉组与模型组比较病理改变明显减轻。假手术组大鼠肾组织中仅少量α－SMA、Col－Ⅲ、TGF－β1、NF－κB p65及TLR2蛋白表达，模型组中上述蛋白表达显著升高；与模型组比较，刺梨冻干粉组、氯沙坦钾组大鼠肾组织中α－SMA、Col－Ⅲ、TGF－β1、NF－κB p65、TLR2蛋白显著降低（P＜0．01）；刺梨冻干粉组肾组织中TLR2、NF－κB p65蛋白较氯沙坦钾组表达显著降低（P＜0．05），α－SMA、Col－Ⅲ、TGF－β1蛋白表达二者比较差异无统计学意义（P＞0．05）。刺梨冻干粉能够明显减轻UUO大鼠肾功能的损害及输尿管梗阻导致的肾纤维化。结论刺梨冻干粉对UUO模型大鼠肾组织局部的免疫微环境有调节作用，能改善肾纤维化。

刺梨冻干粉；肾纤维化；单侧输尿管梗阻模型；免疫微环境

肾纤维化是慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）的病理基础，主要包括肾小球硬化和肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）。研究表明，RIF在促进肾功能恶化中起着主要作用［1］。随着人们对RIF认识的不断加深，很多学者认为各种肾脏病导致RIF的形成过程中存在“共同通路”，涉及一系列相互关联的过程，肾脏天然免疫研究为这一学说提供了新的证据。

刺梨是药食两用的水果，具有多种生物活性物质，药理学研究相对比较成熟，被运用于多种疾病研究领域且疗效肯定。因此，以单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）模型大鼠为研究对象，以α平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，α－SMA）、Ⅲ型胶原（collagenⅢ，Col－Ⅲ）、转化生长因子β1（transforming growth factor－β1，TGF－β1）、核转录因子－κB p65（NF－κB p65）、Toll样受体2（Toll－like receptor，TLR2）为观察指标，探讨刺梨冻干粉改善肾纤维化的作用机制。

材料与方法

一、实验动物与主要试剂及仪器

1．实验动物 雄性SPF级SD大鼠32只，体质量140～160 g，由上海西普尔一必凯实验有限公司提供，合格证号为 DA942C48－72F76A1E－466ABC83－FC6974；并饲养于上海中医药大学实验动物中心，饲养于温度25℃、12 h光照、45%～55%湿度的环境中，自由饮水，普通饲料进食。适应性喂养1周后行模型制备。

2．药物制备 刺梨冻干粉购自国药集团金刺梨（贵州）科技开发有限公司，氯沙坦钾片购自默沙东制药有限公司（批号：L037309）。

3．主要试剂及仪器 α－SMA试剂盒（ab124964，Abcam公司）、Col－Ⅲ试剂盒（ab6310，Abcam公司）、TGF－β1试剂盒（ab92486，Abcam公司）、NF－κB p65试剂盒（cst8242，CST公司）、TLR2试剂盒（sc－10739，Santa Cruz公司）、GAPDH试剂（sc－47778，Santa Cruz公司）、PVDF Transfer Membrane（Millipore）、电泳仪（PowerPacTMHC＃1645052，美国Bio－RAD公司）、荧光显微镜＋数码成像系统（801，日本尼康公司）。病理标本制备及染色均由上海中医药大学附属曙光医院肾病研究所协助完成。

二、方法

1．动物模型的制备及分组 按文献［3］方法建立UUO模型，假手术组仅暴露肾脏后缝合。32只大鼠从中随机选取8只作为假手术组，其余24只制作UUO模型。术后第2天，随机分组将UUO模型大鼠分为模型组、氯沙坦钾组、刺梨冻干粉组，每组8只。

2．干预治疗及标本 干预剂量均参照Bios氏原法设定，氯沙坦钾组给予氯沙坦钾片灌胃，剂量为1 mg／100 g；刺梨冻干粉组给予剂量为300 mg／100 g，假手术组、模型组均给予生理盐水，以上4组均以1 ml／100 g灌胃。在给药过程中，刺梨冻粉组因灌胃手法问题，死亡1只。首次给药后14 d，收集24 h总尿液量，并取5 ml进行检测。戊巴比妥钠麻醉后，经腹主动脉采血，摘取左侧肾脏，置于冰盒上，用0．9%的生理盐水洗净，留取肾门处肾脏横断面组织于多聚甲醛中固定，为观察病理学改变制备石蜡包埋，剩余肾组织迅速置于液氮中备用。

3．肾功能评估 血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、24 h尿蛋白定量使用全自动生化检测仪检测。

4．肾组织病理 肾组织标本行苏木精－伊红（Hematoxylin Eosin，HE）和马松（Masson）染色以观察肾组织病理改变。Masson染色半定量分析，随机选取8个互不重叠高倍视野（×400），应用图像分析软件Image Pro Plus 6．0计算肾间质蓝色着色占全片范围，以反映肾组织的纤维化程度。

三、免疫组织化学方法测定α－SMA、Coll－Ⅲ蛋白的表达

采用Envision System二步法。将玻片烘箱中烘烤，脱蜡至水化，置于磷酸盐缓冲液（PBS）中浸泡，放于水浴中进行抗原修复，冷却至室温，经PBS浸泡后，将玻片放在湿盒内，置甲醇溶液中，反复于PBS中浸泡。吸玻片上过多的水分，加上血清孵育30 min，擦去过多的血清，加入一抗室温孵育过夜，PBS洗3次后，擦去水分，加二抗孵育，PBS洗3次，3，3－二氨基联苯胺（DAB）显色（镜检出现黄色即可终止实验），将水冲洗，苏木素染核，水冲洗复染后，用盐酸酒精分化，脱水、封片。随机选取8个互不重叠高倍视野（×400），应用图像分析软件Image Pro Plus 6．0计算棕黄色胶原纤维着色占全片范围，以反映α－SMA、Coll－Ⅲ蛋白的表达。

四、蛋白免疫印迹法（Western blot）测定TGF－β1、NF－κB p65、TLR2蛋白的表达

肾脏组织加细胞裂解液匀浆破碎，将裂解物移至新的离心管中，取样加入SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）混匀经相关处理后离心去除不溶性沉淀，再次取样使用SDS－PAGE分离，样品行电泳、转膜、封闭，加入一抗，4℃封闭过夜，加入二抗，室温下摇床上孵育1 h；显影。用图像分析软件Gel－Pro Analyzer测定各组蛋白的相对吸光度值（A值）和以目的条带及内参GAPDH条带的灰度比值，分别表示各蛋白的表达水平。

五、统计学处理

应用SPSS18．0统计软件进行分析，各组数据结果以平均数±标准差表示，对实验数据进行ANOVA分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

一、光镜观察

1．HE染色 假手术组肾组织中肾小球形态饱满，系膜细胞无明显增生或硬化，毛细血管管腔规则，充盈，血管壁完整无破损，基质膜无增生、肾小管管腔完整，间质中未见异常细胞。UUO模型大鼠肾小球明显肿大、增生、肥大、排列不规则，系膜细胞变大变厚，局部粘连和硬化，基质膜增宽明显，肾小管管腔不完整，相邻之间有空泡或脱颗粒，有较多的蛋白管型、红细胞管型，大量淋巴细胞、浆细胞浸润肾间质；其中模型组表现最为突出，刺梨冻干粉组和氯沙坦组上述表现相对较轻。（图1）

图1 各组大鼠肾组织HE染色显示情况（×200）

2．Masson染色 假手术组肾组织中肾小球形态饱满，系膜细胞无明显增生或硬化，毛细血管管腔规则，充盈，血管壁完整无破损，基质膜无增生、肾小管管腔完整，间质中未见异常细胞。UUO模型大鼠肾小球肾球囊周围纤维化，基质膜增宽明显，部分肾小球发生玻璃样变和纤维化。（图2）

图2 各组大鼠肾组织Masson染色显示情况（×400）

二、各组大鼠肾功能指标的比较

与假手术组比较，UUO模型大鼠中SCr、BUN及24 h尿蛋白定量明显升高，差异有统计学意义（P＜0．01）；与模型组比较，刺梨冻干粉组、氯沙坦钾组上述各指标明显降低，组间比较差异有统计学意义（P＜0．05），刺梨冻干粉组与氯沙坦钾组进行统计学比较，2组间差异无统计学意义（P＞0．05）。（表1）

表1 各组大鼠SCr、BUN、24 h尿蛋白定量的比较（±s）

表1 各组大鼠SCr、BUN、24 h尿蛋白定量的比较（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0．01；与模型组比较，bP＜0．01；与氯沙坦钾组比较，cP＞0．05

组别 例数 SCr（μmol／L）BUN（mmol／L）24 h尿蛋白定量（mg）假手术组 8 45．30±4．76 6．46±0．52 3．91±0．37模型组 8 165．50±21．77a15．09±1．25a10．50±1．92a氯沙坦钾组 8 133．92±12．79ab13．01±1．12ab8．24±0．53ab刺梨冻干粉组 7 132．67±12．60abc12．80±1．29abc8．20±0．50abc

三、各组大鼠肾组织中α－SMA、Coll－Ⅲ蛋白表达比较

光镜下观察，假手术组肾组织间质分别有少许α－SMA、Coll－Ⅲ的棕黄色胶原纤维染色，手术组间质内能够见到明显的胶原纤维，部分呈现条索状，模型组纤维化面积增高更为明显，刺梨冻干粉组、氯沙坦钾组纤维化面积显著轻于模型组，经半定量分析可见，刺梨冻干粉组与氯沙坦钾比较，差异无统计学意义（P＞0．05）。（表2、图3）。

表2 各组大鼠肾组织α－SMA、Coll－Ⅲ平均吸光度比较（±s）

表2 各组大鼠肾组织α－SMA、Coll－Ⅲ平均吸光度比较（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0．01；与模型组比较，bP＜0．01；与氯沙坦钾组比较，cP＞0．05

组别 例数 α－SMA Coll－Ⅲ假手术组 8 0．04±0．01 0．152±0．014模型组 8 0．24±0．01a 0．319±0．037a氯沙坦钾组 8 0．22±0．01ab 0．220±0．009ab刺梨冻干粉组 7 0．23±0．01abc 0．221±0．007abc

图3 各组大鼠肾组织中α－SMA、Coll－Ⅲ平均吸光度

四、各组大鼠肾组织中TGF－β1、NF－κB p65、TLR2蛋白表达比较

与假手术组比较，UUO模型大鼠TGF－β1、NF－κB p65、TLR2蛋白相对表达水平显著明显升高，经统计学分析，差异有统计学意义（P＜0．01）；模型组与刺梨冻干粉组、氯沙坦钾组比较，上述指标蛋白表达幅度明显增高（P＜0．01）；刺梨冻干粉组与氯沙坦钾组比较，在降低TGF－β1蛋白表达水平上，两者差异无统计学意义（P＞0．05）；刺梨冻干粉组在降低NF－κB p65、TLR2蛋白表达水平上优于氯沙坦钾，差异有统计学意义（P＜0．05）。（表3、图4）。

表3 各组大鼠肾组织中TGF－β1、NF－κB p65、TLR2蛋白表达值（±s）

表3 各组大鼠肾组织中TGF－β1、NF－κB p65、TLR2蛋白表达值（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0．01；与模型组比较，bP＜0．01；与氯沙坦钾组比较，cP＞0．05，dP＜0．05

组别 例数 TGF－β1 NF－κB p65 TLR2假手术组 3 1．00±0．11 1．00±0．15 1．00±0．17模型组 3 1．97±0．15a12．52±0．87a 2．08±0．14a氯沙坦钾组 3 1．63±0．11ab11．65±0．56ab 1．77±0．12ab刺梨冻干粉组 3 1．62±0．12abc9．50±0．46abd1．60±0．14abd

讨 论

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）已成为全球性疾病之一，部分CKD持续恶化，成为终末期肾脏疾病（end stage renal disease，ESRD）［4］。ESRD的治疗主要包括透析和肾移植，其疗效肯定，但发病率高、并发症多、且花费大，严重影响人们的身心健康，因此防治CKD进展显得尤为重要。RIF是多种CKD发展至ESRD的最后主要通路和主要病理基础，也是防治CKD的主要切入点之一。

RIF具体发病机制仍不十分明了，但多数专家认为是一种以免疫反应为驱动，在多种免疫细胞及肾固有细胞的参与下，通过自身分泌和促进炎性细胞因子化的病理过程。在疾病的起始阶段，病原体入侵活化免疫效应细胞，启动天然免疫，浸润的炎性细胞通过产生并分泌炎性因子和促进多种细胞因子的表达，直接或间接引起组织损伤；同时，在多种内外刺激因素下，肾小管及肾间质发生增殖，活化以及表型转化，引起过多细胞外基质的表达，直接参与免疫炎症反应和纤维化的发生、发展过程，最终导致肾组织结构、功能的改变。临床可见血尿、蛋白尿、肾小球滤过率降低等表现。

先天免疫系统作为首道防线，是组织微环境中抵御病原体的关键组成部分［5］，它们通过自身的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别潜在病原体，对致病原产生免疫反应。PRRs主要包括Toll样受体家族（Toll－like receptors，TLRs）、蛋白激酶R（ativated protein kinase R，PKR）等其他家族受体。其中，TLRs是识别病原微生物中最具有代表性的一类PRRs，随着TLRs的分子结构、识别方式、信号传导等多方面的研究深入，发现TLRs及其信号通路在纤维化增生性疾病的发生、发展中有着直接联系［6］。

由此可见，天然免疫系统中TLRs与间质纤维化密切相关。在组织微环境中，根据TLRs呈递细胞表面Ⅰ型或Ⅱ型MHC分子的抗原不同，T淋巴细胞识别的抗原不同，决定了Th1、Th2和Treg细胞因子极化方向，而极化方向是决定组织纤维化和组织重构的关键因素［7］。在进行性肾纤维化中，TLR家族通过识别病原体的相关分子结构，如外源性配基脂多糖、脂蛋白、肽聚糖，或坏死小管细胞产生热休克蛋白和细胞外基质分子等作为内源性配基提供给TLR2和TLR4，使得对TLR活化产生应答的肾固有细胞和免疫细胞进一步被细胞外基质激活并促进炎性反应细胞因子和趋化因子分泌，通过参与依赖MyD88和非依赖MyD88信号通路促进并共同刺激分子的表达，参与免疫应答介导肾组织损伤。当TLR2和TLR4的信号持续存在，或细胞外基质降解失衡及坏死细胞未被清除，则可造成持久间质炎性反应及纤维化［8］。

TLR2是TLRs家族中的一员，是内源性配基的主要受体之一。TLR2主要是通过激活MyD88通路，通过活化p38 MAPK／TRAF6信号，最终活化NF－κB核因子，参与纤维化炎症的形成。在TLR2介导的MyD88非依赖通路中，TLR2可降低自噬活性，促进纤维化转归；同时，可活化MAPK／ERK1／2通路活化Th2型免疫反应，促进Th2型免疫反应促进纤维化转归。TLR2参与了NF－κB和MAPK的活化，刺激产生强烈的促Th2免疫炎症反应，活化氧化应激反应，增加促纤维化因子的生成，抑制抗纤维化因子的表达，最终导致组织纤维化发生［910］。近年来，有关实验表明NF－κB是调节炎症反应的核心因子［2］。既然TLR2可激活NF－κB，所以推测TLR2在RIF中可能发挥了重要作用。

NF－κB p65是组成Rel蛋白家族，存在于大多数细胞胞质浆中。在静止细胞内，NF－κB p65以无活性形式存在于胞质中，细胞受外界刺激时，细胞核转录因子κB抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor KappaB，IκB）激酶被激活，使NF－κB p65从胞质中释放入细胞核发挥转录激活活性，启动众多细胞因子和炎症介质基因的表达。国内外研究发现，在梗阻性肾病动物模型中，NF－κB p65的出现早于单核巨噬细胞浸润，而在后期巨噬细胞能分泌多种细胞参与肾间质纤维化［11］。经体外实验发现，NF－κB p65可被纤维连接蛋白呈剂量依赖性的活化，且可影响成纤维细胞的生物学特征并表达α－SMA，产生大量Ⅰ、Ⅲ型胶原，引起细胞外基质的过度沉积。大量的临床及实验研究结果表明，Coll－Ⅲ是肾间质纤维化的重要细胞外基质的成分［1213］。实验亦证实固有成纤维细胞一旦激活，多数情况下就能引起成纤维细胞的增殖，而α－SMA也是成纤维细胞活化后的重要标志物之一，因此α－SMA、Coll－Ⅲ成为观察肾脏纤维化的主要标志物之一［14］。

TGF－β1是公认的最重要的致纤维化因子。生理情况下，肾脏中大部分TGF－β1与隐性相关肽（latency－associated peptide，LAP）非共价结合，形成无活性前体复合物。病理情况下，TGF－β1活化，可通过自分泌方式和旁分泌方式作用于间质的成纤维细胞，促使大量细胞外基质的产生，从而抑制基质蛋白的产生及增加蛋白酶抑制剂的生成；同时，有研究表明［15］，TGF－β1是肾小管上皮－间充质转分化中主要诱导因子，促进炎症细胞的浸润，加速纤维化的进程。

通过本研究，进一步证实肾纤维化是一个极为复杂的病理生理过程；免疫炎症反应在起始、维持和肾纤维化过程中发挥了重要作用［16］。先天免疫系统是人体对内外致病原产生免疫应答和炎症反应的第一道防线。TLRs在天然免疫系统中发挥着重要的作用。在组织微环境中，根据TLRs呈递细胞表面Ⅰ型或Ⅱ型MHC分子的抗原不同，T淋巴细胞识别的抗原不同，决定了Th1、Th2和Treg细胞因子极化方向，而极化方向是决定组织纤维化和组织重构的关键因素。刺梨具有多种生物活性物质，并被运用于心血管、肿瘤等疾病研究领域，取得了调节免疫、抗动脉粥样硬化、抗衰老、抗肿瘤等疗效。据我们前期的临床观察发现，其具有延缓肾功能进展，降低血清中TNF－α、TGF－β1的作用。本研究选用保存刺梨生物活性成分（维生素、SOD、刺梨多糖、刺梨黄酮等）稳定性最佳的刺梨冻干粉作为治疗药物，对照采用血管紧张素受体拮抗剂氯沙坦钾片，结果发现：①氯沙坦钾、刺梨冻干粉组病理改变较模型组明显减轻。②假手术组24 h尿蛋白定量、BUN、SCr无明显变化，模型组的上述指标明显升高；与模型组比较，刺梨冻干粉组、氯沙坦钾组24 h尿蛋白定量、BUN、SCr的值明显降低；氯沙坦钾与刺梨冻干粉比较差异无统计学意义。③假手术组大鼠肾组织中α－SMA、Col－Ⅲ蛋白及TGF－β1蛋白表达量少，模型组上述指标明显升高；与模型组比较，刺梨冻干粉组、氯沙坦钾组大鼠肾组织中α－SMA、Col－Ⅲ、TGF－β1蛋白表达水平明显降低；氯沙坦钾与刺梨冻干粉比较，差异无统计学意义。④假手术组大鼠肾组织中少许NF－κB p65、TLR2蛋白的表达，模型组肾组织中上述蛋白表达明显升高，与模型组比较，刺梨冻干粉组、氯沙坦钾组大鼠肾组织中NF－κB p65、TLR2蛋白表达水平明显降低；刺梨冻干粉在降低TLR2、NF－κB p65蛋白相对表达水平上优于氯沙坦钾，差异有统计学意义。以上结果说明，刺梨冻干粉可以通过降低免疫炎性指标的表达及抑制TLR2－NF－κB信号通路，调节免疫微环境，调节极化方向，从而减轻肾纤维化。

本研究发现，刺梨冻干粉可改善UUO模型大鼠的病理组织，改善纤维化指标，调节免疫炎性指标的作用。同时，刺梨长期服用安全放心，无不良反应，为临床治疗慢性肾脏病提供一定的理论依据。

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Effect of Cili freeze－dried powder on renal fibrosis model in rats and intervention mechanism

LIU Ming－jie＊，ZHAN Ji－hong，GUO Yin－xue，WANG Zong－rui，HU Mao－rong．＊Guiyang College of Traditional Chinese，Guiyang550002，China

ZHAN Ji－hong，E－mail：zhanjihong59＠163．com

ObjectiveTo observe the effects of Cili freeze－dried powder on renal fibrosis and inflammatory factors in unilateral ureteral obstruction（UUO）model rats，and explore the intervention mechanism of Cili freeze－dried powder delaying the process of renal fibrosis．MethodsThe SD male rats were divided into four groups：sham operated group，model group，losartan potassium group，Cili freeze－dried powder group．The former two groups were given normal distilled water，and losartan potassium group and Cili freeze－dried powder group were treated with losartan potassium（1 mg／100 g）and Cili freeze－dried powder（300 mg／100 g）respectively．Model rats were sacrificed at 14th day after first administration．The specimens were collected，and the pathological changes of renal tissue were observed．Immunohistochemical method was used to detect alpha－smooth muscle actin（α－SMA），collagen typeⅢ（Col－Ⅲ），and Western blot was used to detect protein expression level of TGF－β1，NF－κB p65 and TLR2．ResultsUnder light microscope，the renal tissue structure in the sham operated group was basically normal and there was no infiltration of inflammatory cells in the stroma，without Collagennous fiber or a little Collagennous fiber changes．The renal tissue structure in the model groupwas disordered，and a large number of inflammatory cell infiltration and obvious interstitial collagen deposits were seen in the interstitium of the kidney．As compared with model group，pathological changes were significantly alleviated in losartan potassium group and Cili freeze－dried powder group，and only a small amount of expression ofα－SMA，Col－Ⅲ，TGF－β1，NF－κB p65 and TLR2 was detected in renal tissue in sham operated group．In the model group，the expression of these proteins increased significantly．As compared with the model group，α－SMA，Col－Ⅲ，TGF－β1，NF－κB p65 and TLR2 proteins were significantly down－regulated in the losartan potassium group and the Cili freezedried powder group（P＜0．01）．As compared with the Losartan potassium group，the expression of TLR2 and NF－κB p65 proteins was significantly reduced in the Cili freeze－dried powder group（P＜0．05），and there was no statistically significant difference in the expression ofα－SMA，Col－Ⅲand TGF－β1（P＞0．05）．ConclusionsThe Cili freeze－dried powder on immune renal tissue in the rat UUO model can modulate the local microenvironment，and can improve the renal fibrosis．

Cili freeze－dried powder；Renal fibrosis；UUO model；Immune microenvironment

2017－05－20

2017－06－18）

10．3969／j．issn．1671－2390．2017．06．010

国家自然科学基金地区科学基金项目（No．H2708）

550002 贵阳，贵阳中医学院（刘铭洁）；550001 贵阳中医学院第一附属医院（詹继红，郭银雪，王琮瑞，胡茂蓉）

詹继红，E－mail：zhanjihong59＠163．com