N-烷基化壳聚糖/白芨多糖复合材料制备

郭亮亮，靳宁宁，王莹，张静

(郑州大学 化工与能源学院，河南 郑州 450001)

壳聚糖价廉易得，止血性[1]、生物相容性良好[2-3]，可广谱抗菌[4]、促进伤口愈合。壳聚糖经N-烷基化改性后，既保留了其优良活性，又增强了其止血性能[5-7]。白芨多糖是从传统中药白芨中提取出的水溶性多糖，可收敛止血、消肿生肌[8-10]，具有多种生理活性[11-13]。离子交联法在制备壳聚糖复合材料过程中，避免了有毒副作用的交联剂的使用，是制备止血材料的理想方法[14]。

本文使用离子交联法制备负载有白芨多糖的N-烷基化壳聚糖冻干粉，以期结合二者的止血性能，利用冻干粉的特性，在达到止血目的的基础上同时起到一定的止痛作用[15]。

1 实验部分

1.1试剂与仪器

壳聚糖(CTS)、三聚磷酸钠、硼氢化钠、氢氧化钠、冰乙酸、无水乙醇均为分析纯；十二醛(95%)，色谱纯；白芨多糖(Bsp，多糖含量50%)，由陕西森弗天然制品有限公司提供；牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉均为生物试剂。

SHZ-D(Ш)水循环式真空泵；PHS-25数字pH计；Φ130×60 ZNCL-GS智能磁力搅拌器；DZF-6020真空干燥箱；AB204-N电子分析天平；Nicolet IR300傅里叶变换红外光谱仪；S-4700场发射扫描电镜；Nanoplus3 Nanoplus纳米粒度与Zeta电位分析仪。

1.2 实验方法

1.2.1N-烷基化壳聚糖(N-CTS)制备 称取CTS粉末2 g，配制质量浓度1%的CTS醋酸溶液，静置除泡备用。将0.55 mL十二醛逐滴加入壳聚糖溶液，搅拌12 h后调节pH=5。配制质量浓度10%的硼氢化钠水溶液，强搅拌下将硼氢化钠水溶液逐滴加入反应体系，2 h后调节反应体系pH=7，用无水乙醇反复洗涤抽滤，真空干燥研磨可得N-CTS粉末。

1.2.2N-烷基化壳聚糖/白芨多糖复合材料(N-CTS/Bsp)制备 以质量浓度3%的醋酸溶液为溶剂，配制一定浓度N-CTS醋酸溶液，静置除泡备用。同样地，配制一定浓度Bsp醋酸溶液，过滤以除去不溶性杂质。配制1 mg/mL三聚磷酸钠(TPP)溶液作为交联剂备用。将N-烷基化壳聚糖溶液与白芨多糖溶液共混，并持续搅拌2 h。调节共混液pH=5，330 r/min转速下，将TPP溶液逐滴加入到共混液，滴加完成后，保持该转速一段时间，之后静置沉淀。将絮状沉淀离心，除去上层清液，沉淀层冷冻干燥即可得到N-CTS/Bsp。

1.3 N-烷基化壳聚糖的表征

1.3.1 红外光谱分析 采用KBr压片法，将N-CTS、CTS粉末与溴化钾粉末混合研磨压片，使用红外分光光度计进行扫描，将二者红外光谱图进行对比分析。

1.3.2 元素分析 取N-CTS、CTS粉末，使用扫描电镜所附带的X射线能谱元素分析功能对其进行元素分析。分别测量出N-CTS以及CTS中碳、氮两种元素的分布以及元素百分比，进而计算出N-CTS的取代度。

其中，C/N为测量所得碳氮比，α为壳聚糖的脱乙酰度，SD为N-烷基化壳聚糖的取代度。

1.4 复合冻干粉的表征

1.4.1 紫外光谱测定 取Bsp原料以及所制备的复合冻干粉分散溶于3%乙酸水溶液，形成2 mg/mL的Bsp醋酸溶液以及复合冻干粉醋酸溶液，使用紫外分光光度计研究其紫外吸收情况。

1.4.2 扫描电镜测定 取所制备的复合冻干粉，首先放入50 ℃恒温干燥箱进行干燥处理，喷金后使用扫描电镜对复合冻干粉的形貌进行观察。

1.4.3 冻干粉粒径测定 取所制备的复合冻干粉，分散于无水乙醇中，超声一段时间后静置，取上清液用纳米粒度分析仪对所制备复合冻干粉粒径分布进行测试分析。

1.5 复合冻干粉的性能研究

1.5.1 吸水性测定 称取一定质量所制备的冻干粉，于70 ℃烘箱中干燥至恒重，称重记为W1。将冻干粉置于生理盐水中，待冻干粉吸水达到平衡，取出冻干粉，将吸水后的冻干粉置于一定坡度玻璃板沥水，称取沥水后冻干粉的重量，记为W2，则冻干粉吸水性(%)可用以下公式计算：

1.5.2 降解性测定 用失重法测定冻干粉的降解性。配制磷酸盐缓冲液(PBS)，称取溶菌酶，溶解到PBS溶液中形成降解液(溶菌酶4 mg/mL)。称取复合冻干粉干燥至恒重，称重记为M1。取西林瓶编号并称重记为M2，将冻干粉置于盛有一定体积降解液的西林瓶中，缓慢摇动，使得冻干粉与降解液充分接触。将西林瓶(含降解液及冻干粉)置于37 ℃恒温培养箱降解，及时更新西林瓶内的降解液。用去离子水重复洗涤几次，烘干称重记为M3。冻干粉的失重率(%)可用以下公式进行计算：

1.5.3 抑菌性测定 采用扩散法测定复合材料的抑菌性。配制复合材料原液，将灭菌后的纸片放入复合材料液，轻微振荡，使纸片完全没入材料液内，一段时间后将纸片取出，于超净工作台中风干待用。

选取大肠杆菌作为革兰氏阳性菌代表、金黄色葡萄球菌作为革兰氏阴性菌代表，配制106CFU/mL的菌悬液，用移液枪转移200 μL菌悬液到固体培养基，涂布均匀，将负载有复合材料的纸片贴于培养基表面，将培养基置于30 ℃恒温培养箱培养，一段时间后观察材料周围抑菌圈出现情况，对复合止血材料的抑菌性进行评价。

2 结果与讨论

2.1 红外光谱分析

图1 壳聚糖和N-烷基化壳聚糖红外光谱

2.2 元素分析

图2为原料CTS以及烷基化产物N-CTS分子中C、N元素的分布，图3为每种样品中C、N元素的占比情况。

图2 壳聚糖和N-烷基化壳聚糖C、N元素分布

图3 壳聚糖和N-烷基化壳聚糖C、N元素分析

表1列出了原料CTS以及N-CTS中碳、氮原子百分比，由元素分析，测定了N-烷基化壳聚糖的取代度，同时也进一步证实了烷基醛与壳聚糖成功接枝。

表1 壳聚糖和N-烷基化壳聚糖参数

2.3 紫外光谱分析

由图4可知，白芨多糖原料醋酸溶液(a)在 259 nm 处取得最大吸光度，在233 nm处取得第二个吸收峰；样品c(白芨多糖与N-烷基化壳聚糖投料质量比分别为1∶4，b1w4，下同)与样品b(b3w2)同样在259 nm处取得最大吸光度，其中样品b在 232 nm 处取得第二个吸收峰，样品c在231 nm处取得第二个吸收峰，说明所制备的复合冻干粉成功负载了白芨多糖。此外，样品中白芨多糖的负载量随投料比增大而增大。

图4 白芨多糖、冻干粉紫外光谱

2.4 扫描电镜分析

图5与图6分别为复合冻干粉b1w4与b4w1的扫描电镜的图像。图5中，A与B为b1w4冻干粉放大30 000倍后的形貌，可看出该冻干粉呈现出多孔网络结构，具有较为丰富的孔道，这为其吸附血液提供了足量的场合及较大表面积；C与D为冻干粉放大10 000倍后的形貌，可以看出，冻干粉表面凸凹不平，这为其与血液中血小板以及血浆蛋白的相互作用提供便利。图6中，从A到D分别为b4w1冻干粉从放大30 000倍到2 000倍后的形貌。可明显看出，该冻干粉表面具有大量的突起，分布均匀，且该突起所形成的网络结构较为丰富，这些突起可能是与N-烷基化壳聚糖复合后的大量白芨所形成。这些突起使得复合冻干粉在与血液接触后，白芨多糖迅速溶解并参与到凝血过程中，从而加速凝血实现快速凝血成为了可能。此外，大量的突起与孔道结构，也有助于冻干粉可以更好地吸附红细胞、血小板并与纤维蛋白作用，加速止血。

图5 b1w4冻干粉扫描电镜

图6 b4w1冻干粉扫描电镜

2.5 冻干粉粒径分析

由图7可知，两种原料比例复合冻干粉的粒径分布均较为集中，其中b1w4平均粒径为14.79 μm，b4w1平均粒径为10.18 μm。b1w4平均粒径稍大于b4w1，即随着冻干粉中N-烷基化壳聚糖占比增加，冻干粉粒径随之增大。这可能是由于在冻干粉中，N-烷基化壳聚糖比例越高，其与交联剂交联所形成的沉淀体积越大，沉淀负载的白芨多糖随之增加，造成冻干粉粒径增加。同时可得出，所制备冻干粉粒径与红细胞相近。

图7 冻干粉粒径分析

2.6 吸水性分析

良好的吸水性，可一定程度上反映出复合材料的血液吸附能力。由图8可知，随着白芨多糖添加比例增加，复合冻干粉的吸水率先升高后降低，在w3b2时达到最大值340.2%。这可能是由于当N-CTS占投料比例最高(w4b1)时，所形成沉淀所含N-CTS比例最高，N-CTS与交联剂所形成的网络多孔结构具有一定强度，且占沉淀比重较大，冻干粉吸水溶胀受到一定限制，吸水率相对较高；当N-CTS与Bsp的比例为3∶2时，沉淀中N-CTS占比适中，强度较w4b1稍低，该沉淀溶胀性能较高，所含Bsp比例适度，故此时沉淀吸水率最高；在w2b3及w1b4时，沉淀中N-CTS占比较低，沉淀结构较为松散，Bsp虽有一定吸水能力，但此时所负载的Bsp量并未随着其投料量的增加而明显增加，所形成的沉淀未能吸附更多的液体，故此时沉淀的吸水性较低。

图8 冻干粉吸水率随原料比例变化

2.7 降解性分析

降解性对于生物材料至关重要。复合材料降解过快时，可能造成二次出血等症状；复合材料降解过慢则会影响创面的正常愈合。良好的复合材料应具备适宜的降解速率。由图9可知，各个样品在第一周降解较为迅速，之后降解速度略微降低，但仍降解较快。其中冻干粉w1b4，即冻干粉中Bsp含量较高时，该冻干粉降解速率最高，四周可降解75%左右，与之相比，冻干粉 w4b1降解稍慢，4周降解近60%。冻干粉在第1周与其之后降解速率的差异，可能是冻干粉内部Bsp易溶解且易降解引起。冻干粉内的白芨多糖具有良好的水溶性，在降解第1周时，大量Bsp溶解进入降解液，被快速降解，加之部分N-CTS同时被降解，故第1周降解速率较之后快。在第2周及之后，大部分Bsp已被降解，虽然N-CTS持续被降解，但其降解速率低于Bsp，故降解速率较之前低。

图9 冻干粉降解随原料比例变化

2.8 抑菌性分析

图10中，A为复合材料对大肠杆菌生长的抑制情况，B为复合材料对金黄色葡萄球菌生长的抑制情况。图中各纸片负载复合材料质量均为0.1 mg，详细情况见表2。

图10 冻干粉抑菌性能

观察两种细菌生长情况，由图10A可知，负载材料的各纸片边缘处均出现环状抑菌圈，且抑菌环的宽度(抑菌圈半径与纸片半径之差)从1～5逐渐减小，6处抑菌环宽度与3处大致相同；与A类似，B中抑菌环同样从1～5依次减小，6处抑菌环宽度与3处大致相同。使用游标卡尺量取各个抑菌环宽度，结果见表2。

表2 冻干粉抑菌环宽度

由表2可知，整体来看，复合材料对大肠杆菌的抑制作用强于对金黄色葡萄球菌，且在较高浓度下，复合材料对两种细菌的抑制作用相差不大，较低浓度时，差异明细。此外，复合材料的抑菌性随着N-烷基化壳聚糖的含量增加而增强。与大肠杆菌相比，复合材料对金黄色葡萄球菌的抑菌性受N-烷基化壳聚糖的负载量影响较大。复合材料具有与壳聚糖相当的抑菌性，可为接触部位持续提供无菌环境，可有效避免创面的感染，有利于伤口愈合。

3 结论

以N-CTS、Bsp为原料，通过离子交联法制备了不同Bsp含量的N-CTS/Bsp复合冻干粉，理化表征及性能表明，Bsp负载量与投料量呈正相关，冻干粉呈三维多孔网络结构，吸水性较强，从侧面显示出其较强的血液吸收能力，降解速率随着Bsp比例的增加而加快，抑菌性良好，且抑菌性随着N-CTS比例增加而增强。综合考虑各指标，确定冻干粉最佳制备条件为：N-烷基化壳聚糖与白芨多糖比例为4∶1，原料总浓度为2 g/L，N-CTS与交联剂的正负电荷比为20∶1。在此条件下制备的复合冻干粉具有较高产率89%，良好的吸水性能327%，适宜的降解速率，4周降解59.4%，粒径分布均匀，平均粒径 14.79 μm，与血小板大小相近，且N-烷基化壳聚糖占比较高，具备良好的抑菌性，具备作为止血材料使用的巨大潜力。