血液循环中miR－126作为标志物对2型糖尿病肾脏疾病患者诊断的临床意义

郭晓莉 陈艳 马卫国 王清艳 杜燕 李莎莎

·论著·

血液循环中miR－126作为标志物对2型糖尿病肾脏疾病患者诊断的临床意义

郭晓莉 陈艳 马卫国 王清艳 杜燕 李莎莎

目的探讨血液循环中miR－126作为标志物对2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）肾脏疾病患者诊断的临床意义。方法选择2008年1月至2015年12月西安医学院第一附属医院肾病内分泌科住院的T2DM肾脏疾病患者80例，根据尿蛋白水平将患者分为糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease，DKD）组（40例）和糖尿病尿蛋白正常组（T2DM组，40例）。DKD组根据患者尿蛋白含量又分为微量蛋白尿组（22例）、大量蛋白尿组（18例）。选择同期性别及年龄相近的健康志愿者40例作为健康对照组。对80例患者行空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL－C）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、血白蛋白（albumin，Alb）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL－C）、血肌酐（SCr）、血浆D－二聚体等指标检测并估算肾小球滤过率（estimation of glomerular filtration rate，eGFR），应用实时荧光定量PCR法检测所有患者血液循环中miR－126水平。比较miR－126与重要临床指标的相关性。采用单因素、多因素线性回归分析，确定影响2型糖尿病肾脏疾病及DKD中微量蛋白尿和大量蛋白尿患者的危险性因素。结果T2DM组、DKD组和健康对照组组间比较，在年龄、性别方面差异无统计学意义（P＞0．05），具有可比性。与健康对照组比较，T2DM组在FBG、HbA1c、SCr、miR－126相对表达量方面差异有统计学意义（P＜0．05）；DKD组在BMI、平均血压值、FBG、HbA1c、TC、LDL－C、TG、Alb、白蛋白／肌酐、SCr、eGFR、miR－126相对表达量方面差异有统计学意义（P＜0．05）。与T2DM组比较，DKD组在平均血压值、TG、Alb、白蛋白／肌酐、SCr、eGFR、miR－126相对表达量方面差异有统计学意义（P＜0．05）。miR－126与TC、LDL－C呈负相关（P＜0．05），与HDL－C呈正相关（P＜0．05）。Cox比例风险回归模型多因素分析结果显示，FBG＞4 mmol／L、HbA1c＞5%、LDL－C＞2 mmol／L、miR－126相对表达量＜25是影响2型糖尿病肾脏疾病患者的危险性因素（P＜0．05）。FBG＞8 mmol／L、HbA1c＞9%、LDL－C＞4 mmol／L、miR－126相对表达量＜4、TG＞2 mmol／L是影响DKD患者微量蛋白尿和大量蛋白尿的危险性因素（P＜0．05）。结论血液循环中miR－126相对表达量偏低是影响2型糖尿病肾脏疾病患者的危险性因素。在2型糖尿病肾脏疾病患者临床诊断中，血液循环中miR－126水平可作为其标志物或治疗靶点。

miR－126；2型糖尿病；糖尿病肾脏疾病；临床诊断

糖尿病肾脏疾病（diabetic kidney disease，DKD）是由于糖代谢发生异常所致的肾小球硬化并伴尿蛋白含量大于正常值，是糖尿病全身性微血管病变表现之一，也是导致终末期肾脏疾病的主要原因［1］。该病的临床特征主要是蛋白尿、渐进性肾功能损伤、水肿、高血压，晚期会出现严重性肾衰竭［2］。目前，通过药物治疗可以减缓或延缓该病的进展，但仍然缺乏有效的临床手段阻止DKD走向晚期肾衰竭阶段。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一种小分子非编码RNA，其主要作用机制是通过抑制或降解靶基因的mRNA参与机体多种生理及病理过程［3］。有研究显示，特异性miRNA在DKD患者的肾脏组织可见，其表达丰度在一定程度上可以反映患者病情的变化［4］。此外，有研究团队发现了很多胰岛特异性的miRNAs，并指出这些miRNAs与胰岛的发育、胰岛素的生成及分泌、胰岛素的作用密切相关［5］。本研究为探讨血液循环中miR－126作为标志物对2型糖尿病肾脏疾病（T2DKD）患者诊断的临床意义，应用荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测各组患者血液循环中miR－126的相对表达水平，并应用多因素线性回归分析影响2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus， T2DM）、DKD的危险性因素。

资料与方法

一、研究对象与分组

选择2008年1月至2015年12月西安医学院第一附属医院肾病内分泌科住院的T2DKD患者80例，男50例，女30例，年龄32～67岁，平均年龄（55．2±12．2）岁。根据尿蛋白水平将患者分为DKD组（40例）和糖尿病尿蛋白正常组（T2DM组，40例）。DKD组40例，男24例，女16例；年龄32～66岁，平均年龄（55．0±12．3）岁。T2DM组40例，男26例，女14例；年龄34～67岁，平均年龄（55．5±12．1）岁。DKD组根据患者尿蛋白含量又分为微量蛋白尿组22例和大量蛋白尿组18例。另选择同期性别及年龄相近的健康志愿者40例作为健康对照组，男24名，女16名，年龄32～64岁，平均（55．3±12．4）岁。T2DM组、DKD组和健康对照组在年龄、性别方面差异无统计学意义，具有可比性。本研究获得我院医学伦理学委员会批准，且所有研究对象均知情同意。

二、纳入和排除标准

1．纳入标准 T2DM组尿蛋白排泄率（urinaryalbumin excretion rate，UAER）＜30 mg／d，DKD组UAER≥30 mg／d，微量蛋白尿组UAER在30～300 mg／d，大量蛋白尿组UAER＞300 mg／d；符合1999年世界卫生组织关于T2DM病的诊断标准［6］；签署T2DKD治疗知情同意书患者。

2．排除标准 继发性或其他类型糖尿病，恶性肿瘤、外伤、感染及自身免疫性疾病患者；既往有严重冠心病、肝肾功能衰竭等基础疾病；未签署T2DKD治疗知情同意书患者。

三、方法

1．基本资料记录 患者入院时应详细记录其性别、年龄，测量身高、体质量及血压，根据病例结合临床记录其糖尿病病程。体质量指数（body mass index，BMI）＝体质量（kg）／身高2（m2）。

2．生化指标检测 收集所有组别患者的清晨空腹外周静脉血2～10 ml及尿液，应用深圳雷杜公司RT7200全自动血液分析仪检测血常规。应用日本奥林巴斯公司AU2700型全自动生化分析仪测定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL－C）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、血白蛋白（albumin，Alb）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL－C）、蛋白尿、血肌酐、血浆D－二聚体等指标，计算白蛋白／肌酐比值。一部分血清转移至1．5 ml离心管中，－80℃保存备用。

3．肾小球滤过率估算（estimation of glomerular filtration rate，eGFR） eGFR＝a×（血肌酐／b）c× 0．993年龄。其中，a值：女性黄种及白种人＝144，男性＝141；女性黑人＝166，男性黑人＝163。b值：男性＝0．9，女性＝0．7。c值：女性，血肌酐≤11．97 μmol／L者为－0．329，血肌酐＞11．97μmol／L者为－1．209；男性，血肌酐≤11．97μmol／L者为－0．411，血肌酐＞11．97μmol／L者为－1．209［7］。

四、实时荧光定量PCR

将保存的血清在室温下充分溶解，根据RNA提取试剂盒操作说明进行总RNA提取；将提取的总RNA根据反转录试剂盒说明合成cDNA；根据SYBR Green荧光定量PCR试剂盒说明，制备20μl反应体系，在Thermo Fisher Scientific 7900HT荧光定量PCR仪中扩增，反应条件为95℃预变性10 min、95℃15 s、60℃60 s、40个循环（上游引物UCGUACCGUGAGUAAUAAUGC；下游引物CGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCG TTCCATATTTTT）［8］。

五、统计学处理

应用SPSS19．0统计软件进行分析，计量资料以均值±标准差表示，多组计量资料的比较采用方差分析，两组计量资料的比较采用t检验，计数资料采用秩和（χ2）检验。相关性研究采用Spearman秩相关性分析。采用单因素、多因素线性回归分析，确定影响T2DM、DKD患者的危险性因素，P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

一、检测指标

与健康对照组比较，T2DM组在FBG、HbA1c、血肌酐、miR－126相对表达量方面差异有统计学意义（P＜0．05）；DKD组在BMI、平均血压值、FBG、HbA1c、TC、LDL－C、TG、Alb、白蛋白／肌酐、血肌酐、eGFR、miR－126相对表达量方面差异有统计学意义（P＜0．05）。与T2DM组比较，DKD组在平均血压值、TG、Alb、白蛋白／肌酐、血肌酐、eGFR、miR－126相对表达量方面差异有统计学意义（P＜0．05）。（表1）

表1 各组临床检测指标的比较±s）

表1 各组临床检测指标的比较±s）

注：与健康对照组相比，aP＜0．05，bP＜0．01；与T2DM组相比，c P＜0．05

项目 T2DM组（n＝40）DKD组（n＝40）健康对照组（n＝40）02平均血压值（mmHg） 86．39±10．28 97．20±10．29ac82．46±9．72糖尿病病程（年） 10．21±2．39 10．38±2．31 0 FBG（mmol／l） 8．67±2．24b 8．60±1．22b 4．05±0．39 HbA1c（%） 8．89±2．73b 9．33±2．64b 4．72±0．58 TC（mmol／L） 4．43±1．21 4．69±1．15b 4．01±0．55 LDL－C（mmol／L） 2．81±1．34 4．42±1．53a 2．15±0．51 HDL－C（mmol／L） 1．25±0．23 1．26±0．21 1．23±0．24 TG（mmol／L） 1．71±0．55 2．52±1．32bc1．62±0．61 Alb（mg／d） 6．21±2．67 225．35±102．54bc5．51±1．16白蛋白／肌酐（mg／mmol） 1．01±0．61 27．65±11．49bc0．88±0．50血肌酐（μmol／L） 66．19±13．69a120．32±39．43bc52．17±10．54 eGFR［ml·min－1·（1．73 m2）－1］ 95．28±10．38 65．30±15．77bc100．43±14．29 miR－126相对表达量 11．32±2．34b 4．38±1．03bc25．39±3．BMI（kg／m2） 25．33±3．55 26．29±5．03a 24．31±4．62

二、miR－126与重要临床指标的相关性分析

相关性分析结果显示，miR－126与TC（r＝－0．03，P＜0．01）、LDL－C（r＝－0．03，P＜0．01）呈负相关，与HDL－C呈正相关（r＝0．02，P＜0．01）。miR－126与FBG、HbAlc、TG、血肌酐及蛋白尿均无显著相关性（r值分别为0．54、0．44、－0．48、0．38、0．20，P均＞0．05）。

三、影响T2DKD患者的多因素分析

Cox比例风险回归模型多因素分析结果显示，FBG＞4 mmol／L、HbA1c＞5%、LDL－C＞2 mmol／L、miR－126相对表达量＜25是影响T2DKD患者的危险性因素（P＜0．05）。（表2）

四、影响DKD患者微量蛋白尿和大量蛋白尿患者的多因素分析

Cox比例风险回归模型多因素分析结果显示，FBG＞8 mmol／L、HbA1c＞9%、LDL－C＞4 mmol／L、miR－126相对表达量＜4、TG＞2 mmol／L是影响DKD患者微量蛋白尿和大量蛋白尿的危险性因素（P＜0．05）。（表3）

讨 论

DKD在糖尿病患者中的发生率约为20%～40%。目前，关于DKD的发病机制尚不十分清楚，在临床治疗上主要是通过控制血糖、血压及纠正血脂异常实现患者短期改善，但这些治疗方法只能减慢DKD进展至肾衰竭的进程，并不能逆转或阻止病情发展。微小RNA（miRNAs）是长度约为22个核苷酸的一类小的非编码RNA。在人体中，主要通过与靶mRNA的3，非编码区部分或完全互补结合，发挥其介导靶mRNA抑制其蛋白质翻译的作用［9］。国内外相关文献报道，miRNAs在血浆、红细胞、血小板和有核细胞介质中被发现［10］。有研究指出，miRNAs与糖尿病的发病机制有关［11］。因此，在深入认识DKD发病机制的背景下，提出miRNAs在DKD中的靶向调控作用有可能成为DKD的新的标志物及治疗靶点，对其DKD发病的关键环节进行干预，防止疾病的发生及发展，对改善DKD患者的预后意义重大。

miR－126是miRNAs中的一类，其靶基因是胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate－1，IRs1）。IRs1作为胰岛素信号系统的重要调节者，使得miR－126能够通过靶向抑制IRS1诱导胰岛素抵抗［12］。有研究指出，内皮细胞中高浓度miR－126水平在血管生成中起着关键作用［13］。还有研究表明，T2DM患者血液循环中miR－126水平低于正常健康人群［14］。此外，血液循环中miR－126水平的变化已被报道与DKD、糖尿病微血管损伤和终末期肾脏疾病的发展相关［15］。本研究旨在探讨血液循环中miR－126作为标志物对T2DKD患者诊断的临床意义，其结果显示，与健康对照组比较，T2DM组和DKD组血液循环中miR－126水平均显著降低（P＜0．05）。此外，T2DM组的FBG、HbA1c、血肌酐，DKD组的BMI、平均血压值、FBG、HbA1c、TC、LDL－C、TG、蛋白尿、白蛋白／肌酐、血肌酐、eGFR与健康对照组比较，差异均有统计学意义（P均＜0．05）。这或许提示上述因素是T2DKD患者以及DKD患者微量蛋白尿和大量蛋白尿患者中的危险性因素。

王勾琴等［16］研究指出miRNAs中miR－150－5p和miR－155－5p可能参与DKD发生和发展的病理过程，并且上述非编码RNA有望成为DKD早期诊断及判断预后的潜在分子标志物。鲁双艳等［17］指出血浆miR－126在T2DM组和糖耐量正常组表达量差异无统计学意义，而miR－375在T2DM组表达上调，对T2DM诊断具有潜在应用价值。Zampetaki等［18］研究则指出在T2DM患者中miR－28－3p过表达，而miR－126及另外12个根据基因芯片差异性表达结果选取的miRNAs表达下调，加上从正常糖耐量到糖耐量受损再到糖尿病过程中miR－126表达水平逐渐下降，充分说明非糖尿病患者血液循环中miR－126水平下降是糖尿病的重要预测指标。本研究中FBG偏高、HbA1c偏高、LDL－C偏高和miR－126相对表达量偏低是影响T2DKD患者的危险性因素（P＜0．05），与Park等［19］研究结论一致。此外，为了比较不同蛋白尿组血液循环中miR－126的表达水平，本研究进一步探讨影响DKD患者微量蛋白尿和大量蛋白尿患者的危险性因素，研究结果显示，FBG水平偏高、HbA1c水平偏高、LDL－C水平偏高、miR－126相对表达量偏低和TG水平偏高是影响DN患者微量蛋白尿和大量蛋白尿的危险性因素（P＜0．05）。miR－126与T2DM及DKD相关的机制或许是由于miR－126可通过下调Ebox阻抑蛋白控制转化生长因子β1诱导的Ⅰ型胶原α2表达。另外，miR－126是一种内皮细胞特异性表达的miRNA，其表达水平下降可介导糖尿病患者内皮损伤，损伤的机制可能是通过抑制eNOS而降低一氧化氮的生物活性，或由降低p65蛋白的巯基亚硝基化作用而激活核因子的表达，进而降低蛋白质的巯基亚硝基化作用［20］。此外，miR－126能被各种细胞主动或被动分泌，并以微囊泡、Ago蛋白复合物或高密度脂蛋白的形式运输至受体细胞并发挥生物学功能，这或许也是其中的机制之一。

表2 影响T2DM和DKD的多因素分析

表3 影响微量蛋白尿和大量蛋白尿患者的多因素分析

综上所述，在T2DKD患者临床诊断中，血液循环中miR－126水平可作为其标志物或治疗靶点。

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Clinical significance of miR－126 as marker in the diagnosis of type 2 diabetic kidney disease

GUO Xiaoli，CHEN Yan，MA Wei－guo，WANG Qing－yan，DU Yan，LI Sha－sha．Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Xi＇an Medical University，Xian710077，China

CHEN Yan，E－mail：guoxiaoli1978a＠163．com

ObjectiveTo explore the clinical significance of miR－126 as a marker in the diagnosis of type 2 diabetic kidney disease（T2DKD）．MethodsFrom Jan．2008 to Dec．2015，80 patients with T2DKD in our hospital were selected．The patients were divided into T2DKD group（n＝40）and diabetic control group（T2DM group，n＝40）according to the level of urinary protein．According to the patient＇s urine protein content T2DKD group was divided into microalbuminuria subgroup（n＝22）and macroalbuminuria group（n＝18）．Forty healthy volunteers were selected as healthy control group（n＝40）．The estimated glomerular filtration rate（eGFR），and levels of FBG，HbA1c，HDL－C，TC，TG，LDL－C，triacylglycerol（TG），urinary protein，serum creatinine，plasma D－two dimmer were determined．The miR－126level was detected by real－time fluorescence quantitative PCR．The correlation between miR－126 and important clinical indicators was analyzed．Univariate and multivariate linear regression analysis was used to determine the risk factors of T2DKD patients with microalbuminuria and macroalbuminuria．ResultsAmong T2DM group，T2DKD group and healthy control group，there was no significant difference in age and sex（P＞0．05）．As compared with the healthy control group，There was significant difference in the levels of FBG，HbA1c，serum creatinine and the relative expression of miR－126 between healthy control group and T2DM group（P＜0．05）．Between T2DKD group and healthy control group，there was significant difference in the BMI，FBG，HbA1c，the average value of blood pressure，TC，LDL－C，TG，urinary protein，albumin／creatinine，serum creatinine，eGFR，and the relative expression of miR－126．Between T2DM group and T2DKD group，there was significant difference in the average blood pressure，TG，urinary protein，albumin／creatinine，serum creatinine，eGFR，the relative expression of miR－126（P＜0．05）．MiR－126 was negatively correlated with TC and LDL－C（P＜0．05），and positively correlated with HDL－C（P＜0．05）．Cox proportional hazard regression model revealed that the risk factors of T2DKD patients included FBG＞4 mmol／L，HbA1c＞5%，LDL－C＞2 mmol／L，and miR－126 relative expression＜25（P＜0．05）．The risk factors of T2DKD patients with microalbuminuria and macroalbuminuriawere included FBG＞8 mmol／L，HbA1c＞9%，LDL－C＞4 mmol／L，miR－126 relative expression＜4，and TG＞2 mmol／L（P＜0．05）．ConclusionsLow relative expression of miR－126in blood circulation is a risk factor for T2DKD patients．In the clinical diagnosis of T2DKD，the levels of miR－126in the blood circulation can be used as a marker or therapeutic target．

miR－126；Type 2 diabetes mellitus；Diabetic kidney disease；Clinical diagnosis

2016－11－26

2017－04－03）

10．3969／j．issn．1671－2390．2017．06．009

710077 西安，西安医学院第一附属医院肾病科

陈艳，E－mail：guoxiaoli1978a＠163．com