灵芝多糖对小鼠黑素瘤B16F10细胞分泌VEGF的抑制作用

李 红，陆 洁，段昕所，齐海花，孙立新

（承德医学院附属医院,河北 承德 067000）

灵芝多糖对小鼠黑素瘤B16F10细胞分泌VEGF的抑制作用

李 红，陆 洁，段昕所，齐海花，孙立新△

（承德医学院附属医院,河北 承德 067000）

目的:探讨灵芝多糖对B16F10黑素瘤细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）的影响。方法：用不同浓度的灵芝多糖处理B16F10黑素瘤细胞，以正常培养基代替灵芝多糖培养B16F10黑素瘤细胞为对照。分别采用Western blot法和Rt-PCR法检测灵芝多糖作用48h后B16F10黑素瘤细胞VEGF蛋白和mRNA表达的变化。结果：浓度为0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml的灵芝多糖处理B16F10细胞后，B16F10细胞VEGF蛋白和mRNA的表达水平均明显降低（P＜0.05）。结论：灵芝多糖可能通过抑制B16F10黑素瘤细胞分泌VEGF起到抑制肿瘤的作用。

灵芝多糖；B16F10黑素瘤细胞；VEGF

黑素瘤(melanoma)是目前首位致死性皮肤肿瘤，发病率呈急速上升趋势，大多见于30岁以上的成年人，可发生于皮肤、黏膜和内脏器官[1]。黑素瘤的主要表现是色素性皮损，在数月或数年中发生明显改变，虽然发病率低但恶性程度高，易转移，预后差。血管内皮生长因子(VEGF)是目前已知活性最强、专属性最高的促血管内皮生长因子，也是肿瘤血管新生过程中重要的始动因素。黑素瘤细胞的生长、转移依赖新生血管生成，在恶性黑素瘤中VEGF的表达水平明显增高，有利于恶性黑素瘤细胞的侵袭和转移，而抑制VEGF的表达可减少新血管生成，抑制黑素瘤细胞的增殖[2-3]。灵芝多糖(GL-PS)是灵芝的主要有效成分之一，大量研究显示灵芝多糖具有良好的抗肿瘤、调节免疫功能等作用[4-5]。本研究采用不同浓度的灵芝多糖作用于B16F10黑素瘤细胞，观察灵芝多糖对B16F10细胞VEGF表达的影响，以期为黑素瘤的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 灵芝多糖（福州绿谷生物药业技术研究所），Rt-PCR的M-MLV第一链合成试剂盒、细胞培养液RPMI-1640、trizol试剂（美国Invitrogen公司），β-actin、VEGF一抗（美国Santa Cruz公司），PCR试剂盒和引物设计(上海生工生物公司)，胎牛血清(FBS，武汉三利生物技术有限公司)，B16F10黑色素瘤细胞(南京凯基生物科技发展有限公司)。1.2 细胞培养 B16F10细胞用含10%胎牛血清、100U/L青霉素和链霉素的RMPI-1640培养液，37℃、5% CO2条件下常规培养。取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化接种于6孔培养板内，每孔2×105个细胞，培养4h后更换为正常培养基或灵芝多糖继续培养48h用于实验（灵芝多糖的浓度分别为0μg/ml、0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml）。

1.3 B16F10黑色素瘤细胞VEGF表达的检测

1.3.1 VEGF蛋白：采用Western blot法。提取细胞总蛋白，定量，每组各取75μg的总蛋白加入上样孔，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF膜转膜，5%脱脂牛奶封闭，一抗（VEGF 1:1000，β-actin 1:1000）4℃孵育过夜，tBSt洗涤后二抗（1:5000）室温孵育2h，ECL发光液胶片显影。胶片扫描胶后的图像后采用Image J 软件进行分析，以β-actin作为内参标准对照，以VEGF蛋白条带与β-actin条带的灰度值比值作为VEGF蛋白的相对表达水平。每组实验重复3次。

1.3.2 VEGF mRNA：采用Rt-PCR法。引物序列：上游引物为5′-tCtCGCCAtCttttAtCtCCCAG-3′，下游引物为5′-CAGAACCCAAAtCCCGttAttG-3′。trizol提取细胞总RNA并逆转录成cDNA，进行PCR反应。反应条件：94℃ 2min预变性；然后变性、退火、延伸（94℃ 30s，57℃30s，72℃ 1min），30个循环；最后72℃ 5min延伸。将扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，BioRad凝胶成像仪采集、分析图像，以VEGF mRNA条带与β-actin条带灰度值的比值作为VEGF mRNA的相对表达水平。每组实验重复3次。

2 结果

浓度为0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml的灵芝多糖处理B16F10细胞后，VEGF蛋白和mRNA的表达明显低于0μg/ml组（P＜0.05）；灵芝多糖浓度为0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml的B16F10细胞，VEGF蛋白和mRNA的表达比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见附表、图1-2：

附表 B16F10细胞VEGF的表达情况（±s ，n=3)

附表 B16F10细胞VEGF的表达情况（±s ，n=3)

与0μg/ml组比较：aP＜0.05；与0.2μg/ml组比较：bP＜0.05

灵芝多糖（μg/ml）VEGF蛋白VEGF mRNA 01.63±0.471.28±0.160.21.77±0.161.13±0.090.80.74±0.07ab0.97±0.08a3.20.82±0.07ab0.88±0.06a12.80.41±0.10ab0.75±0.14ab

图1 Western blot法检测B16F10细胞VEGF蛋白的表达（1.0μg/ml，2.0.2μg/ml，3.0.8μg/ml，4.3.2μg/ml，5.12.8μg/ml）

图2 RT-PCR法检测B16F10细胞VEGF mRNA的表达（1.0μg/ml，2.0.2μg/ml，3.0.8μg/ml，4.3.2μg/ml，5.12.8μg/ml）

3 讨论

黑素瘤(melanoma)是一种发生于黑素细胞的恶性肿瘤，侵袭能力高，致病原因尚未完全阐明，基因、环境及基因/环境共同作用等危险因素与黑素瘤的发生有关，出血、瘙痒、压痛、溃疡等是黑素瘤的主要临床表现。黑素瘤容易发生早期转移且因对化疗产生耐药而预后不良，因此需要寻找有效的措施治疗黑素瘤[6]。灵芝多糖由肽多糖、葡聚糖、杂多糖等组成，研究发现灵芝多糖具有调节免疫、抗氧化、抗肿瘤、降血糖及抗糖尿病并发症等多方面的作用[7-8]。

研究表明，缺氧是促进肿瘤细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）的主要原因之一。在人体内肿瘤细胞生长越活跃、局部代谢就越旺盛，导致肿瘤细胞因缺氧而加强诱导VEGF的表达，从而促进血管生成并且使处于休眠状态的脉管系统开始脉管芽生[9-12]。足够的血液供应是肿瘤不断生长和在转移部位定位生长所必需的，肿瘤血管新生有利于肿瘤的血供，而VEGF在肿瘤血管新生中具有重要作用，因此，抑制肿瘤细胞VEGF的表达对于控制肿瘤具有积极意义[13-14]。本研究采用不同浓度的灵芝多糖作用于黑素瘤B16F10细胞，观察了B16F10细胞VEGF蛋白和mRNA表达的变化，发现0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml浓度的灵芝多糖处理黑素瘤B16F10细胞，VEGF蛋白和mRNA的表达水平明显降低，说明灵芝多糖具有抑制B16F10细胞表达VEGF的作用，这可能是灵芝多糖发挥抗肿瘤作用的机制之一。因此，值得深入探讨灵芝多糖的抗肿瘤作用机制。

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INHIBITORY EFFECTS OF GANODERMA LUCIDUM POLYSACCHARIDES ON VEGF SECRETION IN B16F10 MELANOMA CELLS

LI Hong, LU Jie, DUAN Xin-suo, et al
(the Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the effects of Ganoderma lucidum polysaccharides (GL-PS) on secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF) in B16F10 melanoma cells. Methods: B16F10 melanoma cells were treated with or without different concentrations of GL-PS for 48h, then the expression of VEGF protein and mRNA was respectively detected by Western-blot and RT-PCR. Results:Compared with control group, the expression of VEGF protein and mRNA in B16F10 melanoma cells decreased obviously after the B16F10 melanoma cells were treated with different concentrations of GL-PS (0.8μg/ml, 3.2μg/ml, 12.8μg/ml) for 48h (P＜0.05). Conclusions:GL-PS may play a role in inhibiting tumor by inhibiting secretion VEGF in B16F10 melanoma cells.

Ganoderma lucidum polysaccharides;B16F10 melanoma cells;Vascular endothelial growth factor (VEGF)

R33

A

1004-6879（2017）04-0276-03

2016-10-14）

△通讯作者