雷公藤甲素对高迁移率族蛋白1诱导的破骨细胞分化的影响

王 贵，郭明慧，徐慧慧，黄 晶，吕 爽，赵宏艳，肖 诚

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中日友好医院临床医学研究所，北京 100029；3.中国中医科学院医学实验中心，北京 100700）

实验研究

雷公藤甲素对高迁移率族蛋白1诱导的破骨细胞分化的影响

王 贵1，2，郭明慧1，2，徐慧慧1，2，黄 晶1，2，吕 爽1，2，赵宏艳3，肖 诚2⋆

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中日友好医院临床医学研究所，北京 100029；3.中国中医科学院医学实验中心，北京 100700）

目的：观察雷公藤甲素（TP）对高迁移率族蛋白1（HMGB1）诱导的破骨细胞（OC）分化及晚期糖基化终末产物受体（RAGE）mRNA表达的影响。方法：取C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞，经RANKL、M-CSF及不同浓度HMGB1刺激后，采用TRAP染色及活性检测，观察OC分化及其功能。再给予TP干预，观察其对HMGB1诱导的OC分化情况及RAGE mRNA表达的影响。结果：与HMGB1浓度为0ng/ml组比较，HMGB1浓度500ng/ml及1000ng/ml组TRAP阳性OC数目显著增加，TRAP活性显著增强（P＜0.01）。与RANKL+HMGB1诱导组比较，TP组TRAP染色阳性OC数目显著减少、TRAP活性显著降低 （P＜0.01），OC RAGE mRNA表达明显降低 （P＜0.05）。结论：HMGB1能够促进OC分化，TP对HMGB1刺激的OC分化及功能起抑制作用，其机制可能与下调OC RAGE基因表达有关。

雷公藤甲素；类风湿关节炎；破骨细胞；高迁移率族蛋白1；晚期糖基化终末产物受体

Author’s addressBeijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

高迁移率族蛋白1（high mobility group protein B1，HMGB1） 在 类 风 湿 关 节 炎 （rheumatoid arthritis，RA）患者血清及关节滑膜组织高表达，且在伴有骨破坏的病人中，其表达量显著增高[1]，其作为炎性因子具有促进骨组织吸收的作用[2]，在RA疾病的进程中发挥重要作用[3～5]。晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）是 HMGB1 的受体，在破骨前体及成熟的破骨细胞 （osteoclast，OC）可表达。HMGB1通过RAGE受体途径，发挥趋化作用，介导炎症反应[6]。抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate，resistant alkaline phosphatase，TRAP） 是OC特异性标志酶，参与骨吸收过程，可对其特异性染色计数OC数目，其活性反映OC功能[7]。有研究显示，HMGB1参与了胶原诱导型关节炎 （collage-induced arthritis，CIA）模型大鼠滑膜增生、软骨及骨质破坏的病理过程，而雷公藤多苷片可减轻其病理过程，其机制与降低HMGB1表达相关[8，9]，雷公藤多苷片是临床治疗RA的常用药，具有很强的抗炎、抗氧化、免疫抑制等作用，在RA的临床治疗中取得了肯定的效果。雷公藤甲素（triptolide，TP）是雷公藤多苷片的主要有效成分之一。课题组前期研究发现TP对OC分化及骨吸收作用有明显的抑制效应[10]，本研究旨在通过观察TP对HMGB1诱导的OC分化、成熟的影响及RAGE mRNA表达的变化，探讨其治疗RA骨破坏的作用机理，为临床用药提供依据。

1 材料

1.1 动物

5～7周龄雄性C57BL/6小鼠，由北京维通利华实验技术有限公司提供 （啮齿动物许可证编号SCXK 2012-0001），饲养于中国中医科学院基础理论研究所清洁级实验动物室 （实验动物使用许可证号 SYXK（京）2016-0021）。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂

雷公藤甲素（TP）购于美国Sigma公司，货号T3652-1MG；小鼠重组HMGB1蛋白，美国eBioscience公司；α-MEM培养基，美国Hyclone公司；青霉素、链霉素，美国Gibco公司；FBS胎牛血清，美国BioTech公司；小鼠重组核因子κB受体活化因子配基 （RANKL）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），美国 Peprotech 公司；TRAP 试剂盒，美国Sigma公司；RIPA裂解液，美国Cell Signaling科技公司；引物合成，上海生工；总RNA提取试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMII RT-PCR试剂盒，日本Takara公司。

1.2.2 主要仪器

二氧化碳培养箱、Varioskan Flash全波长扫描荧光酶标仪，美国Thermo Scientific公司；荧光定量PCR仪，美国Applied Biosystems公司；LEICA QWin图像分析系统，德国LEICA公司。

2 方法

2.1 破骨前体细胞的分离与培养

取C57BL/6小鼠，脱颈处死，75％酒精消毒5～10min，分离股骨、胫骨，收集骨髓细胞悬液用含20ng/ml M-CSF的α-MEM培养液接种于25cm2培养瓶中，在5％CO2、37℃条件下贴壁过夜。收集未贴壁细胞，用含20ng/ml M-CSF的α-MEM培养液 （含 10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素）重悬细胞以 1×105个/孔加入预置盖玻片的96孔培养板内孔，培养3d后得到破骨前体细胞。

2.2 HMGB1对破骨前体细胞分化的影响

得到破骨前体细胞后，换液为含20ng/ml MCSF、10ng/ml RANKL 及 不 同 浓 度 HMGB1（0、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml）的α-MEM培养液，隔天换液1次。每组设3个复孔。

2.2.1 显微镜计数

培养第6d取盖玻片，TRAP染色后，倒置相差显微镜下计数玻片上TRAP染色阳性 （细胞核≥3）OC数目。

2.2.2 OC TRAP活性检测

细胞培养至第6d，弃上清，每孔加入50μl RIPA裂解液，冰上震荡裂解10min，离心后转移每孔上清至新的96孔板中，加入等量TRAP活性反应液 （100mmol/L柠檬酸钠，pH 5.0，50mmol/L酒石酸钠，5mmol/L磷酸对硝基苯酯），37℃避光孵育1h，加入等量0.1mmol/L NaOH终止反应，酶标仪405nm波长处检测吸光度值。

2.3 TP对HMGB1诱导破骨前体细胞的干预

按前述方法得到破骨前体细胞后，换液为含20ng/ml M-CSF、10ng/ml RANKL、1μg/mlHMGB1，含或不含TP10nM的α-MEM培养液。各组给药情况如表1示，观察TP对OC分化及RAGE mRNA表达的影响。

表1 各组的给药方法

2.3.1 显微镜计数（方法同前）

2.3.2 TRAP活性检测（方法同前）

2.3.3 Real-time PCR方法

培养至第6d的各孔细胞按TaKaRa RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，琼脂糖电泳法检测RAGE mRNA基因浓度及完整性。Real-time PCR步骤按TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTmII试剂盒说明书进行，扩增条件为95℃变性30s，95℃ 5s，60℃ 30s，扩增40个循环，引物序列为：RAGE上游引物TGGAAACTGAACACAGGAAGG，下游引物TGGAAGGAGGAGTGAACCAT。根据检测结果，分析扩增曲线和溶解曲线，按照2-△△ct相对定量公式计算各组目的基因相对定量结果。

2.4 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行统计分析，正态分布数据采用单因素方差分析。非正态分布数据采用非参数检验Kruskal-Wallis单因素ANOVA。

3 结果

3.1 HMGB1对破骨前体细胞分化的影响

图1A（见封底）、图1B示，与对照组相比，HMGB1 浓度 10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml组OC细胞分化数目较少，有增加的趋势，但无显著性差异。 HMGB1浓度 500ng/ml及1000ng/ml组可见多核巨细胞状成熟分化的OC，较对照组显著增加（均 P＜0.01）。

3.2 不同浓度HMGB1对OC TRAP活性的影响

图2示，与对照组相比，HMGB1 500ng/ml及1000ng/ml组 TRAP活性显著增高 （均 P＜0.01），提示HMGB1能促进OC的分化。

3.3 TP对HMGB1诱导的OC分化的影响

图3A（见封底）、图3B示，与单独RANKL诱导组相比，RANKL+HMGB1组OC分化明显，体积变大，数目增多（P＜0.01）；加入 TP（10nM）干预后OC分化受抑制，OC数目明显减少（P＜0.01）。

3.4 TP对HMGB1诱导的OC TRAP活性的影响

图4示，经RANKL、HMGB1共同诱导刺激的OC较单独RANKL诱导组，TRAP活性显著升高（P＜0.01）。 TP 给药组 TRAP 活性较 RANKL+HMGB1诱导组显著降低（P＜0.01），说明 TP抑制了OC的分化成熟。

3.5 TP对HMGB1诱导的OC RAGE mRNA表达的影响

图5示，与单独 RANKL诱导组相比，经RANKL、HMGB1共同诱导刺激后RAGE mRNA表达量显著增加（P＜0.01）。与 RANKL+HMGB1 诱导组相比，加入TP后，TP能显著抑制OCRAGE mRNA 的表达（P＜0.05）。 结果表明：TP通过下调HMGB1的受体RAGE基因的表达发挥对HMGB1诱导的OC分化成熟的抑制作用。

图1 B不同浓度HMGB1对破骨前体细胞分化的影响

图2 不同浓度HMGB1对OC TRAP活性的影响

图3 BTP对HMGB1诱导的OC分化的影响

图4 TP对HMGB1诱导的OC TRAP活性的影响

图5 TP对HMGB1诱导OC RAGE mRNA表达的影响

4 讨论

RA是一种炎症型自身免疫性疾病，以渐进性的滑膜炎及骨破坏为主要病理表现，炎症因子在疾病的发生发展过程中起了至关重要的作用。HMGB1是一种晚期炎症介质，是一种高度保守的非组蛋白DNA结合蛋白，在真核细胞核内表达，受到适当刺激时可主动或被动释放到细胞外[11]，广泛的参与炎症反应，具有促炎及免疫刺激性，能够促进RA滑膜炎症反应[12]。临床研究显示活动期RA患者血清HMGB1水平显著增加[13]，且在伴有骨破坏的RA患者中水平明显升高[1]。动物实验研究亦显示，HMGB1在CIA大鼠巨噬细胞、滑膜细胞等多种细胞中表达量升高[14]。给大鼠关节腔注射HMGB1后能够引起关节滑膜炎症，抗体阻断HMGB1后，滑膜炎症缓解[15，16]。本研究结果发现，HMGB1浓度 500ng/ml及1000ng/ml组可明显增加破骨细胞数量及TRAP活性，说明HMGB1能增加破骨细胞骨分化及功能。

本课题组前期实验研究结果表明，雷公藤多苷有抗氧化作用，能提高佐剂型关节炎的抗氧化能力，能减轻细胞的过氧化损伤[17]；降低CIA大鼠的关节炎指数，并降低大鼠关节软骨TNF-α，IL-6，NF-κB和COX-2等炎症因子的表达[18]。有研究显示，HMGB1参与了CIA滑膜增生、软骨及骨质破坏的病理过程，雷公藤多苷治疗RA的关节肿胀机制与降低HMGB1表达相关[8，9]。

本研究显示，TP干预HMGB1诱导的OC后，与RANKL+HMGB1组诱导的OC相比，加入TP（10nM）后，OC 分化受抑制，数目减少（P＜0.01）。RAGE是HMGB1的受体，HMGB1通过RAGE受体途径，发挥趋化作用，介导炎症反应[6]。进一步检测 TP对 OCRAGE mRNA表达的影响，Real Time-PCR结果显示与RANKL+HMGB1诱导组相比，加入TP能显著抑制OCRAGE mRNA的表达（P＜0.05）。表明TP可通过下调HMGB1的受体RAGE基因的表达发挥对HMGB1诱导的OC分化成熟的抑制作用。

综上所述，研究显示HMGB1能够诱导刺激破骨前体细胞分化成熟为 OC，TP能够抑制HMGB1诱导的OC的分化及成熟，降低OC RAGE基因的表达，提示TP治疗RA骨破坏可能是通过影响炎症细胞因子HMGB1受体RAGE的表达而发挥作用。

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The effect of triptolide on differentiation of osteoclasts induced by HMGB1

//WANG Gui，GUO Minghui，XU Hui-hui，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2017 Apr，31（2）：102-106

Objective：To investigate the effect of triptolide （TP）on the differentiation and expression level of RAGE mRNA of osteoclasts induced by high mobility group protein B1（HMGB1）.Methods：Bone marrow mesenchymal stem cells （BMMs）were isolated from the bilateral tibias and femurs of C57BL/6 mice.BMMs were cultured in the presence of RANKL，M-CSF and different concentrations of HMGB1，and were stained by TRAP and measured by TRAP activity to observe the differentiation and maturation of osteoclasts.The expression levels of RAGE were detected by real time-PCR after BMMs were administered by triptolide.Results：Compared with HMGB1 （0ng/ml）group，the number of TRAP positive multinuclear cells and the TRAP activity of osteoclasts of HMGB1 （500ng/ml，1000ng/ml）were significantly increased （P＜0.01）.Compared with RANKL+HMGB1 treated group，TP could reduce the number and the TRAP activity of osteoclasts （P＜0.01）.The expression levels of RAGE was down-regulated by TP（P＜0.05）.Conclusion：HMGB1 could promote the differentiation of osteoclasts.TP could suppress the differentiation and function of osteoclasts induced by HMGB1.The mechanism might be related on the down-regulating of RAGE gene expression.

triptolide；rheumatoid arthritis；osteoclast；high mobility group protein B1；receptor for advanced glycation end products

R285.5

：A

：1001-0025（2017）02-0102-05

10.3969/j.issn.1001-0025.2017.02.010

国家自然科学基金（81373773，81673844）；北京市自然基金（7142144）

2*本文通讯作者。

王 贵（1990-），女，硕士研究生。

2017-01-04

2017-02-20