四逆汤HPLC指纹图谱研究

张 强，韩素芹，王 瑞

（山西中医学院，山西太原030024）

四逆汤HPLC指纹图谱研究

张 强，韩素芹，王 瑞

（山西中医学院，山西太原030024）

目的：建立四逆汤HPLC指纹图谱，为科学评价四逆汤的质量稳定性和均一性及其临床应用提供依据。方法：以传统水提法制备的水煎液，采用HPLC色谱法，Waters-XTerra MS C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脱，检测波长为260 nm，分析时间为70 min，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL。并采用“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件”对10批样品进行相似度评价。结果：建立了四逆汤指纹图谱，10批药材的相似度均大于0.8。结论：建立的四逆汤HPLC指纹图谱测定方法简单，重复性较高，精密度良好，可用于控制四逆汤质量的均一和稳定。

四逆汤；高效液相色谱法；指纹图谱

四逆汤出自《伤寒论》，由附子、炙甘草和干姜组成，作为回阳救逆的代表方剂［1］，用于少阴病阳衰阴盛，四肢厥逆，脉沉微细，神疲欲寐，恶寒倦卧，腹痛下利，呕吐不渴，舌苔白滑等。其配伍精简，收载于历版中国药典。在现代临床中应用广泛，多用于救治急性肠胃炎吐泻过度、心肌梗死、心力衰竭，或因误汗、过汗所致休克等阳衰阴盛者［2］。近年来亦有相关文献报道其质量研究［3］。四逆汤作为中药复方，其所含化学成分复杂、药材质量参差不齐、实际煎煮方法不同等诸多因素导致临床应用疗效存在很大的差异［4］。为确保其质量均一稳定和临床用药安全有效，需建立可靠的质量及疗效评价方法［5］。中药指纹图谱在一定条件下能基本反映中药化学成分的全貌，使其质控标准提升，由对单一成分含量测定变为对整个中药供试品内在品质的控制，实现对中药内在的质量综合评价和整体物质的全面控制［6］。HPLC色谱法高效快速的分离能力有利于四逆汤指纹图谱的建立和研究，有助于系统地表征四逆汤的质量［7］。本文通过HPLC色谱法建立四逆汤的指纹图谱，并比较10批样品的相似度，为科学评价四逆汤质量的均一稳定以及临床应用提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪 器

戴安U-3000高效液相色谱仪（自动进样器，三元泵，DAD检测器）；国家药典委员会推荐“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”（2004版）；FA224型号电子分析天平（上海舜宇恒平仪器有限公司）；SY-5000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ5200V型超声波清洗机（昆明市超声仪器有限公司）。

1.2 试 剂

甘草苷对照品（批号：111610-201106，中国药品生物制品检定所）；甘草酸对照品（批号：150419，上海融合医药科技有限公司）；甘草素对照品（批号：150510，上海融合医药科技有限公司）；甲酸、甲醇、盐酸、醋酸铵均为分析纯（天津市科欧密化学试剂有限公司），乙腈为色谱纯（OCEANPAK公司），水为纯净水。

1.3 药 材

四逆汤药材（炮附子、干姜、炙甘草），炮附子经山西中医学院裴香萍副教授鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.子根的加工品，干姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根茎，炙甘草为豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎。供试药材来源见表1，均符合2015版中国药典要求。

表1 不同来源的四逆汤药材

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters-XTerra MS C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱程序为5%：95%（0 min）→83%：17% （70 min）；检测波长为260 nm，分析时间为70 min，进样量为10 μL，流速为1.0 mL/min，柱温25℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取甘草苷、甘草素、甘草酸对照品适量，精密称定后甲醇溶解配制成浓度为0.5 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取黑附片15 g，炙甘草6 g，干姜6 g，加10倍量水先浸泡30 min，煎煮30 min后倒出药液，再加入8倍量水，煎煮20 min，合并水煎液，用纱布过滤，在旋转蒸发仪上浓缩至250 mL，待药液冷却后定容于250 mL容量瓶中，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 对照试验 取10 μL混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，色谱图见图1。

图1 对照品HPLC色谱图

2.3.2 精密度试验 按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液1份，精密移取10 μL，按照“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱峰图谱，并以10号峰（甘草素）作为内参峰，进行对比分析。结果表明：其共有峰的相对保留时间RSD值均小于1.72%，相对峰面积RSD值均小于4.94%。

2.3.3 重复性试验 按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，各精密移取供试品溶液10 μL，按照“2.1”项下色谱条件，分别进样1次，记录色谱峰图谱，并以10号峰（甘草素）作为内参峰，进行对比分析。结果表明：其共有峰的相对保留时间RSD值均小于1.96%，相对峰面积RSD值均小于4.88%。

2.3.4 稳定性试验 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液1份，精密移取四逆汤供试品溶液10 μL，按照“2.1”项下色谱条件，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h时分别进样分析，记录色谱峰图谱，并以10号峰（甘草素）为内参峰，进行对比分析。结果表明：其共有峰的相对保留时间RSD值均小于2.71%，其相对峰面积RSD值均小于4.87%，说明四逆汤供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4 指纹图谱的建立与相似度的分析

2.4.1 参照峰的选择 甘草素为四逆汤中药理活性成分之一，并且其含量较大，峰面积稳定，易于辨认，分离度较好，因此选定甘草素峰作为HPLC指纹图谱参照峰。

2.4.2 特征峰的确定 以10个不同来源的四逆汤为对象进行指纹图谱研究。通过比较其紫外吸收光谱与保留时间的方法，确认其共有指纹峰包括甘草素（10号峰）在内的15个共有色谱峰。通过比对其保留时间、比较紫外吸收光谱以及对照品加入法，指认了其中3个色谱峰，分别为甘草苷（9号峰）、甘草素（10号峰）、甘草酸（14号峰），色谱图见图2。

图2 四逆汤对照指纹图谱

2.4.3 指纹图谱相似度评价 取10批样品，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，分别进样进行检测分析，记录指纹图谱。将10批四逆汤的数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，生成对照指纹图谱后对10批四逆汤对照分析，结果如图3和表2所示，10批四逆汤样品的相似度均大于0.8。

图3 10批四逆汤指纹图谱的相似度对比

3 讨 论

3.1 流动相体系的选择

在四逆汤HPLC指纹图谱的建立过程中，首先选用流动相体系为0.1%醋酸铵溶液（pH=10）-乙腈进行分析，色谱峰较少，且醋酸铵溶液是缓冲盐溶液，在有机溶剂比例较大时溶液易析出细小结晶，导致色谱柱堵塞。改用流动相体系0.1%甲酸水溶液-乙腈后，虽然色谱峰较多，但分离度不好，调整洗脱梯度也得不到改善。最终选用流动相体系为0.1%甲酸水溶液-甲醇，基线相对平稳，色谱峰的数目较多，分离度良好，峰形较好，同时色谱峰的对称性良好。

3.2 测定波长的选择

实验过程中，在波长250 nm下色谱峰的峰高和峰形相对较好，但是在波长250 nm下基线漂移严重。综合考虑在波长260 nm下，基线较为平稳，各色谱峰的峰形大小合适且分布均匀，可以较完全表达四逆汤中各类成分的出峰情况，因此选择测定波长为260 nm。

3.3 试样处理方法的选择

四逆汤按照传统煎煮方法得到的水煎液，采用了以下3种方法进行预处理：①水煎液直接进样；②水煎液旋转蒸发至干，甲醇超声溶解；③水煎液旋转蒸发至干，0.5%盐酸甲醇超声溶解。在甲醇和0.5%盐酸甲醇液的指纹图谱中，色谱峰较多，但分离度差；而四逆汤水煎液的峰形较好，基线平稳，且临床应用为传统水提法制得的水煎液，更加接近临床应用，可为临床应用以及质量控制提供依据，所以选用水煎液直接进样。

表2 10批四逆汤指纹图谱的相似度对比

3.4 相似度的对比

在相似度对比过程中，购自10个不同药店的10批四逆汤样品的相似度均大于0.8。说明通过控制加水量和煎煮时间可以得到质量稳定均一的四逆汤，为临床疗效的稳定提供依据。

［1］邓中甲.方剂学［M］.北京：中国中医药出版社，2011：138.

［2］谢鸣，周然.方剂学［M］.北京：人民卫生出版社，2012：160.

［3］王跃生，李欣晴，饶毅，等.高效液相色谱法测定四逆泡腾片中甘草黄酮含量［J］.药物分析，2012，32（12）：2 168-2 171.

［4］芦苇，梁光义，杨玉琴，等.四逆汤HPLC指纹图谱研究［J］.时珍国医国药，2013，24（3）：661-663.

［5］高志祥，姜寒笑，王岩，等.HPLC法同时测定四逆汤中3种有效成分的含量［J］.中国医药大学学报，2011，40（7）：662-664.

［6］蔡宝昌.中药分析学［M］.北京：人民卫生出版社，2012：110.

［7］王海燕，周严严，容蓉，等.HPLC-MS联用分析不同制法四逆汤中化学成分［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（22）：103-107.

（编辑：梁葆朱）

Study on fingerprint of Sini decoction

Zhang Qiang，Han Suqin，Wang Rui
（Shanxi College of TCM，Taiyuan Shanxi 030024）

Objective：To develop fingerprint of Sini decoction and provide basis for evaluating stability and homogeneity of Sini decoction and its clinical application.Method：Sini decoction was prepared by traditional water extraction.Waters-XTerra MS C18column（4.6 mm×150 mm，5 μm）was taken with methanol（A）-0.1%formic acid water solution（B）as mobile phase.The detection wavelength was set at 260 nm and analysis time was 70 minites.The flow rate was at 1.0 mL/ min and the sample size was 10 μL.10 batches of samples were carried similarity evaluation by computer aided similarity evaluation software for fingerprint of traditional Chinese medicine.Results：Fingerprint of Sini decoction was established and the similarity of 10 batches of medicinal materials was more than 0.8.Conclusion：The method is simple，good repeatability and precision，and can be used for the quality control of stability and homogeneity of Sini decoction.

Sini decoction；HPLC；fingerprint

R284.1

A

1671-0258（2017）02-0030-04

山西省科技厅项目（2015011103）；山西中医学院博士基金项目

张强，在读硕士研究生，E-mail：zhangfaith518@163.com

王瑞，博士，副教授，硕士生导师，E-mail：wrgreentea@163.com