UPLC法测定木鳖子药材中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯的含量

程志清，韩光磊，洪 燕，韩燕全，郑 新，潘凌宇，韩丽萍

（1.安徽中医药大学第一附属医院，安徽合肥230031； 2.安徽中医药大学，安徽合肥230038）

UPLC法测定木鳖子药材中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯的含量

程志清1，韩光磊1，洪 燕2，韩燕全1，郑 新2，潘凌宇2，韩丽萍2

（1.安徽中医药大学第一附属医院，安徽合肥230031； 2.安徽中医药大学，安徽合肥230038）

目的：建立UPLC法测定木鳖子中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯含量的方法，并对不同产地样品进行测定。方法：Waters BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，线性梯度洗脱；流速0.25 mL/min，柱温30℃，检测波长203 nm。结果：丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯浓度与峰面积在0.35～5.60 μg之间线性关系良好（r=0.999 6），加样回收率为97.98%，RSD为1.60%。结论：该方法简便、快捷、重复性好，可用于木鳖子药材的质量控制。

木鳖子；UPLC；丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯

木鳖子为葫芦科木鳖Momordica cochinchinensis（Lour.）Spreng.的干燥成熟种子，其味苦，微甘，性温，有毒，为临床常用中药之一［1］。木鳖子具有散结消肿、攻毒疗疮之功效，由于其有毒，临床主要外用治疗疮疡肿毒、乳痈、瘰疬、痔瘘、干癣、秃疮等。近年研究表明，木鳖子及其提取物具有较广泛的药理作用，包括抗肿瘤、抗氧化、抗炎镇痛以及用于治疗糖尿病肾病和胰岛素抵抗等。木鳖子中所含的成分有脂肪酸类、活性蛋白类、皂苷类等多种类别，目前已经明确的单体成分有α-菠菜甾醇、熊果酸、齐墩果酸、木鳖子酸、木鳖子素等。其中木鳖子皂苷属于五环三萜齐墩果烷型的双糖链三萜皂苷，可能是其抗肿瘤作用的主要活性成分［2-6］。

《中国药典》2015年版一部规定其含量测定成分为HPLC法测定其丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯（C37H56O10）含量，该成分为木鳖子皂苷降解后的次级苷，结构见图1，其含量较高，是较为理想的含量测定的指标成分。由于木鳖子的产地较多，药材质量有一定差异，不同产地之间的药材优劣目前尚不清楚。本课题在《中国药典》2015年版HPLC法测定丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯方法的基础上，建立该成分的UPLC测定方法，并对不同产地的多批次木鳖子药材进行含量测定，了解该药材的质量状况，为其进一步研究开发提供依据。

图1 丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯化学结构式

1 仪器与试药

1.1 仪 器

Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱系统，配有四元超高压溶剂系统、自动进样恒温样本管理器、柱温箱、PDA检测器和Empower 2色谱工作站（美国Waters公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；KQ3200DB型超声清洗器（江苏昆山超声仪器有限公司）；ME55型十万分之一分析天平（梅特勒-托利上海有限公司）；KDC-16H高速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）。

1.2 试 药

丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯对照品，规格20 mg，由成都普斯生物公司提供，经1H-NMR、13C-NMR、MS、IR和UV等光谱检测确认其结构，按归一化法测得其纯度为98.95%，批号：PS13062101。

21份不同产地和批次的木鳖子药材购自全国各地药店，经安徽中医药大学第一附属医院韩燕全副主任中药师鉴定，均为葫芦科木鳖的干燥成熟种子，具体信息见表2。色谱乙腈购自迪马科技公司，甲醇、磷酸等试剂均为分析纯，水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 供试品的制备

木鳖子药材40℃真空干燥至恒重后，去壳，取一定量粉碎，过40目筛。每批样品称取粉末1.5 g左右，精密称定，置索氏提取器中。加石油醚（60℃～90℃）-三氯甲烷（1∶1）混合溶液150 mL，加热回流1～2 h，弃去石油醚三氯甲烷混合溶液，滤纸筒挥尽溶剂。置圆底烧瓶中，加60%甲醇100 mL，加热回流4 h，提取液水浴蒸干。残渣加水10 mL使溶解并转移至具塞试管中，加硫酸0.6 mL，摇匀，塞紧。置沸水浴中再加热2 h，取出，放冷，滤过，弃去滤液，残渣加色谱甲醇8 mL使溶解，转移至10 mL量瓶中，加硫酸1滴使溶液pH值至2.0，摇匀，定容。50℃水浴中放置4 h，取出放冷，加甲醇补至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.2 对照品的制备

取丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯对照品适量，置于棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成每1 mL含0.70 mg丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯的对照品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱为Waters Acquity BEH C18柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；流动相：A相为乙腈，B相为0.1%的磷酸水溶液；柱温30℃；流速0.25 mL/min。梯度洗脱程序如下：0～2 min，8%～25%A；2～3 min，25%～60%A；3～4 min，60%～8%A；4～6 min，8% A。检测波长为203 nm，理论板数按丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯峰计算应不低于6 000，对照品和木鳖子样品的色谱图见图2。

图2 对照品（A）和木鳖子样品（B）的色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 设定UPLC自动进样对照品溶液0.5 μL、1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL，以色谱峰峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，丝石竹皂苷：Y=2.226 61E6X－232 040.2，r＝0.999 6。结果丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯在0.35～5.60 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.4.2 精密度考察 精密吸取木鳖子对照品丝石竹皂苷1 μL，在上述色谱条件下重复进样6次，测定丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯峰面积积分值，其RSD值为1.21%，仪器精密度表现良好。

2.4.3 稳定性考察 精密吸取供试品（S1号样品）1 μL，在上述色谱条件下定时进样测定，时间间隔为0 h，1 h，2 h，4 h，6 h，12 h。记录丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯峰面积积分值，计算得其RSD值为1.46%，表明供试品至少在12 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性考察 取6份S2号样品粉末，按照“2.1供试品的制备”项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品1 μL，在上述色谱条件下进样，测定供试品丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯峰面积积分值，计算得其RSD值为1.46%，供试品重复性表现良好。

2.4.5 加样回收率实验 取6份S20号样品粉末，每份0.75 g左右，适量对照品溶液，按照“2.1供试品的制备”项下方法制备供试品溶液。精密吸取供试品1 μL，在上述色谱条件下进样，测定供试品丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯峰面积积分值，得其平均回收率为97.98%，RSD（%）为1.60，表明丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯回收率良好。结果见表1。

表1 加样回收率实验

2.4.6 样品含量测定 分别取上述21批不同产地、批次木鳖子样品粉末1.5g左右，按“2.1”项下制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，各样品溶液进样1 μL，以各成分峰面积按外标法计算样品中丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯的含量，结果见表2。

表2 木鳖子样品含量测定结果 （mg/g）

3 讨 论

超高相液相色谱（UPLC）法与高相液相色谱（HPLC）法比较具有分析时间快、灵敏度高、重复性好等特点，在中药质量控制和指纹图谱建立等研究中的应用越来越广泛［7-9］。本研究采用UPLC方法进行含量测定时，在6 min左右就可完成1次进样，且色谱分离效果较为满意。实验过程中考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水等流动相系统及梯度洗脱程序，也优化了柱温、流速、进样量等实验因素，最终得到该实验的色谱条件。

实验建立的丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯含量检测方法简单、稳定、重复性好，测定方法快速，节省了实验的时间，可为木鳖子的质量控制和进一步开发提供依据。木鳖子属于常用中药，《中国药典》2015年版一部对木鳖子的含量控制指标是以HPLC法测定其丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯的含量，以含量不得少于0.25%为合格。在实验过程中，通过UPLC法对21个木鳖子供试样品丝石竹皂苷元3-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯测定结果表明，只有2批样品含量低于《中国药典》2015年版项下不低于0.25%规定，其他样品总体质量较好，同时也说明该质量控制标准较为合理。

［1］国家药典委员会.中国药典（一部）［S］.北京：中国中医药科技出版社，2015：65.

［2］赵连梅，韩丽娜，单保恩，等.木鳖子提取物体外抗肿瘤活性的初步研究［J］.癌变·畸变·突变，2010，22（1）：19-23.

［3］张丹，潘乐，江峥，等.木鳖子提取液抗氧化活性的分析［J］.复旦学报：医学版，2010，37（3）：319-321.

［4］孙付军，路俊仙，崔璐，等.不同含油量木鳖子霜抗炎镇痛作用比较［J］.时珍国医国药，2010，21（5）：1 084-1 085.

［5］Jung K，Lee D，Yu J S，et al.Protective effect and mechanism of action of saponins isolated from the seeds of gac（Momordica cochinchinensis Spreng.）against cisplatin-induced damage in LLC-PK1 kidney cells［J］.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2016，26（5）：1 466-1 470.

［6］Phani M M，Reddy D S，Venkataiah G.Preventive effect of momordica cochinchinensis（lour）.Spreng on high fat diet and along with low dose alloxan induced diabetic nephropathy and insulin resistance in rats［J］.Indo American Journal of Pharmaceutical Research，2013，3（12）：1 540-1 546.

［7］韩燕全，洪燕，桂洁，等.不同产地生、干、炮姜的UPLC指纹图谱比较研究［J］.中成药，2013，35（2）：356-359.

［8］韩燕全，洪燕，高家荣，等.基于UPLC特征指纹图谱和指标成分定量测定研究炮姜的炮制工艺［J］.中草药，2013，44（1）：42-46.

［9］洪燕，韩燕全，夏伦祝，等.不同产地苍耳子UPLC指纹图谱研究［J］.中国中药杂志，2013，38（11）：1 766-1 771.

（编辑：梁葆朱）

Determination of gypsoside 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in Momordica cochinchinensis by UPLC

Cheng Zhiqing1，Han Guanglei1，Hong Yan2，Han Yanquan1，Zheng Xin2，Pan Lingyu2，Han Liping2
（1.The First Affiliated Hospital，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei Anhui 230031；2.Anhui University of Chinese Medicine，Hefei Anhui 230038）

Objective：To develop an UPLC method for determination of gypsoside 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester in Momordica cochinchinensis.Method：Gypsoside 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester was determined on Waters BEH C18column（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）with acetonitrile-0.1%phosphoric acid as mobile phase.The flow rate was 0.25 mL/min and the colum temperature was at 30℃.The detection wavelength was set at 203 nm.Results：The linear relationship between the concentration and the peak area of gypsoside 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester was good at 0.35 μg to 5.60 μg（r=0.999 6）.The average recovery rate was 97.98%and RSD was 1.60%.Conclusion：The method is simple，rapid and good repeatability，and can be used for the quality control of Momordica cochinchinensis.

Momordica cochinchinensis；UPLC；gypsoside 3-O-β-D-glucuronic acid methyl ester

R284.2

A

1671-0258（2017）02-0025-04

国家中医药重点学科临床中药学建设项目（国中医药人教发［2012］32号）；安徽中医药大学临床科研基金（2012LC1-019B）；安徽中医药大学校级探索性科研项目（2016ts041）

程志清，副主任中药师，E-mail：382117974@qq.com

韩燕全，博士，副主任中药师，E-mail：hyquan2003@163.com