婴幼儿配方粉及成人营养品中脂肪酸含量检测方法的性能研究

田 芳

(雅培贸易(上海)有限公司，上海 200213)

婴幼儿配方粉及成人营养品中脂肪酸含量检测方法的性能研究

田 芳

(雅培贸易(上海)有限公司，上海 200213)

目的：建立适用于婴幼儿配方粉及成人营养品中脂肪酸检测的方法，并在不同基质中验证其性能。方法：在AOAC 2012.13方法基础上进一步修改建立了直接甲酯化法，并对其检测婴幼儿配方食品及成人营养品中主要功能性脂肪酸的能力进行验证。方法验证包括其准确性、回收率、精确度及定量限。本实验还研究了此方法在7种不同基质(乳基、豆基、部分水解蛋白及氨基酸配方)婴幼儿配方粉中的适用性，并与现行国标GB 5413.27-2010检测4种脂肪酸的能力进行了比对。同时，还评价了此方法检测包埋DHA原料的能力。结果：直接甲酯化法表现出了良好的准确性、回收率及精确度，在不同基质及使用不同包埋工艺的DHA原料中均显示了很好的适用性。此方法与现行国标方法测定7种乳粉试样中的4种脂肪酸的结果一致性均在90%～106%范围内，表现出了很高的一致性。结论：直接甲酯化法预处理步骤简单、方便、快捷，作为乳粉样品中脂肪酸含量的日常检测方法具有较大的推广潜力及价值。

直接甲酯化法；乙酰氯甲醇法；脂肪酸；方法性能；乳粉；包埋DHA

多不饱和脂肪酸花生四烯酸(ARA)和二十二碳六烯酸(DHA)对婴幼儿的大脑和神经系统的发育以及成人的代谢和心血管健康都起到至关重要的作用。目前，国内外检测婴幼儿配方粉及成人营养品中脂肪酸含量的方法主要有GB 5413.27—2010 “婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定”[1]及AOAC 2012.13“毛细管气相色谱检测乳制品及婴幼儿配方食品中的标签脂肪酸的含量”[2]。国标一法乙酰氯甲醇法使用外标法定量，实验室间的检测结果偏差较大，且试剂乙酰氯为强腐蚀试剂，不利于操作人员及环境的健康。AOAC 2012.13为直接甲酯化法，待测样品不需经过脂肪提取，使用相对温和的甲醇钠甲醇溶液对甘油三酯上的脂肪酸直接进行水解甲酯化，并使用十一碳脂肪酸甲酯作为内标进行定量。本实验在AOAC 2012.13方法基础上，并参考了Cantellops等的研究成果[3]建立了直接甲酯化法，为了更好的反应实验过程的影响因素，选择了十三碳甘油三酯作为内标进行定量。对所建立的直接甲酯化法的准确度、回收率、精确度及定量限(LOQ)进行了验证，并对此方法在不同基质营养品中的适用性及检测包埋DHA的能力进行了评价。

1 材料与方法

1.1 试剂

氨水(28%～30%)、甲醇钠甲醇溶液(0.5mol/L)，购于Sigma-Aldrich；氯化钠及乙酰氯，均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；甲基叔丁基醚(MTBE)、甲醇及正己烷均为色谱纯，购于Thermo-Fisher。

十一碳酸甘油三酯、十三碳酸甘油三酯、十八碳二烯酸甘油三酯、十八碳三烯酸甘油三酯、二十碳四烯酸甘油三酯、二十二碳六烯酸甘油三酯及脂肪酸甲酯混标(40种，GLC 617)，均购于Nu-Chek Prep.。

1.2 样品

质控样：NIST SRM 1849a；乳粉样品：7种。试样1、2、3、4为乳基婴幼儿配方粉；试样5：含大豆蛋白的较大婴儿及幼儿配方粉；试样6：含部分水解蛋白的婴幼儿配方粉；试样7：含全水解蛋白的婴幼儿配方粉；试样1～7均为雅培中试试验样品。包埋DHA样品：2种。试样8：BASF包埋DHA，由BASF公司提供；试样9：Kievit包埋DHA，由Friesland Campina Kievit公司提供。

1.3 仪器与设备

气相色谱仪(具有氢火焰离子检测器，FID)：安捷伦7890 B；毛细管色谱柱：SUPELCO 2560，100 m × 0.25 mm，0.2 μm；离心机：ThermoFisher Scientific Heraeus Multifuge X3R；漩涡振荡器：Fisher Scientific；恒温水浴，上海精宏实验设备有限公司；分析天平(精确至0.1 mg)：Mettler Toledo MS 304S。

1.4 方法

1.4.1 直接甲酯化法 本实验室在AOAC 2012.13方法基础上建立了直接甲酯化法，用于检测婴幼儿配方粉及其它乳品中各脂肪酸组分的含量。称取一定量的样品(乳粉0.2 g、液态乳1 g)于50 mL玻璃离心管中，加入1 mL水充分溶解(液态乳可跳过此步)，加入5 mL十三碳酸甘油三酯内标溶液(2.0 mg/mL于MTBE)，混匀后再加入5 mL甲醇钠甲醇溶液(0.5mol/L)，旋紧盖子，充分振摇，室温下静置3.5 min进行水解甲酯化。之后再依次加入2 mL正己烷及5 mL饱和氯化钠溶液，漩涡振摇30 s，2 000r/min离心5 min，取上层清液有机相进行GC分析。

1.4.2 乙酰氯甲醇法 本研究中使用的乙酰氯甲醇法是在国标GB/T 5413.27—2010方法一的基础上稍做修改。乙酰氯与甲醇反应得到的盐酸—甲醇使试样中的脂肪和游离脂肪酸甲酯化，用正己烷提取后，经气相色谱仪分离检测，外标法定量。本方法只适用于水份含量低于5%的试样中脂肪酸组分的分析，所以本研究中只用此方法检测了乳粉样品。准确称取适量的乳粉样品(0.25 g)于螺口玻璃反应瓶中，加入3 mL 10% 乙酰氯甲醇溶液，并充分混匀。将反应瓶放入80oC恒温水浴中反应2 h，期间每15 min取出振摇1次。反应结束后，将反应液取出冷却至室温，加入2.5 mL正己烷并充分涡旋30 s，然后加入2.5 mL饱和氯化钠溶液并充分混匀。将试样液3 000 r/min离心5 min，取上层清液有机相进行GC分析。将十八碳二烯酸甘油三酯、十八碳三烯酸甘油三酯、二十碳四烯酸甘油三酯及二十二碳六烯酸甘油三酯溶于正己烷中配制标准工作溶液，标准工作溶液经过与试样相同的预处理过程，进行GC分析，并绘制标准曲线。

1.4.3 色谱条件 色谱柱：SUPELCO 2560，100 m × 0.25 mm，0.2 μm；载气：氦气；载气流速：0.8 mL/min；进样口温度：250℃；进样量：1 μL；分流比：20∶1；检测器温度：250℃；柱温箱温度：初始温度100℃，持续13 min；以10℃ /min 升至 180℃，保持 6 min；以1℃/min升温速率升至200℃，保持20 min；以4℃/min升至 230℃，保持10.5 min。

2 结果与分析

2.1 直接甲酯化法的单实验室验证

2.1.1 准确性 通过检测NIST SRM 1849a试样来验证直接甲酯化法的准确性。乳粉检测中重点关注的4种脂肪酸：亚油酸、α-亚麻酸、ARA及DHA中，NIST SRM 1849a认证证书提供了亚油酸及α-亚麻酸的证书值。所以，本研究通过对比NIST SRM 1849a中亚油酸及α-亚麻酸的10次独立测定结果的平均值与其各自的证书值[4]，来验证直接甲酯化法的准确性。

使用直接甲酯化法测定NIST SRM 1849a中亚油酸及α-亚麻酸的10次独立测定结果见表1，此2种人体必需脂肪酸的检测结果均在标准物质的认证值范围之内，说明直接甲酯化具有很好的准确性。

表1 直接甲酯化法测定NIST SRM 1849a中亚油酸及α-亚麻酸的结果及与证书值的比较

注：所有结果均表示为g脂肪酸每100 g样品。

2.1.2 回收率 选用脱脂乳粉为“空白”基质，其四种脂肪酸的本底的测定值见表2。为便于计算，之后所有的脂肪酸的测定值均表示为g 脂肪酸甲酯每100g 样品。

表2 空白基质脱脂乳粉中亚油酸、α-亚麻酸、ARA及DHA的含量

注：a所有的脂肪酸的测定值均表示为g 脂肪酸甲酯每100g 样品；b脱脂乳粉中未检出DHA。

本研究对含量较低的α-亚麻酸、ARA及DHA的回收率做了进一步的研究。使用α-亚麻酸甘油三酯、花生四烯酸甘油三酯及二十二碳六烯酸甘油三酯标准品配制合适浓度的标准溶液，并于脱脂乳粉中进行加标回收率测试。每种脂肪酸均做3个不同浓度水平的加标回收测试：α-亚麻酸为0.01、0.05、0.10 g/100g；ARA及DHA为0.002、0.01、0.02 g/100g。每个加标水平做3个平行，测试结果见表3。

表3 直接甲酯化法测定乳粉中α-亚麻酸、ARA及DHA含量的加标回收率

注:所有的脂肪酸的测定值均表示为g 脂肪酸甲酯每100g 样品。

表3结果显示，α-亚麻酸、ARA及DHA在3个加标水平的回收率均在90%～110%之间，且3个平行的RSD均小于10%，说明直接甲酯化法测定乳粉中的脂肪酸含量具有很好的回收率。

2.1.3 精密度 本研究对直接甲酯化法检测乳粉中亚油酸、α-亚麻酸、ARA及DHA含量的精密度也进行了验证。每种脂肪酸，对含有3个不同浓度水平的样品进行了检测，每个浓度水平独立测定6次(表4)。

表4 直接甲酯化法检测乳粉中不同浓度水平的亚油酸、α-亚麻酸、ARA及DHA含量的精密度

注: 所有的脂肪酸的测定值均表示为g 脂肪酸甲酯每100g 样品。

由表4的结果可知，使用直接甲酯化法检测3个不同含量水平脂肪酸的样品时，每个浓度水平独立测定6次的RSD值均小于10%，显示此方法具有很好的精密度。

2.1.4 定量限 使用脱脂乳粉为空白基质，在定量限LOQ水平进行加标回收测试，3次独立测定结果的回收率用于评价确定方法检测4种脂肪酸的定量限。

由表5的结果可知，亚油酸和α-亚麻酸在0.01 g/100g的加标水平的回收率均在90%～110%之间，ARA及DHA在0.002 g/100g加标水平的回收率也均在90%～110%之间。故直接甲酯化法检测乳粉中亚油酸和α-亚麻酸的定量限为0.01 g/100g乳粉，ARA及DHA的定量限为0.002 g/100g乳粉。

表5 直接甲酯化法检测乳粉中亚油酸、α-亚麻酸、ARA及DHA含量的定量限

注：所有的脂肪酸的测定值均表示为g 脂肪酸甲酯每100g 样品。

2.2 直接甲酯化法与乙酰氯甲醇法对不同基质样品测定结果的比较

7种不同基质的婴幼儿配方乳粉(乳基、豆基、部分水解蛋白及氨基酸配方)被选做试验样品，来进一步评价直接甲酯化法检测乳粉中主要脂肪酸的性能，并与现行国标GB 5413.27—2010方法1的测定结果作比较。显著性分析(t检验，α=0.05)结果显示，两种方法测定7种乳粉试样中的亚油酸、α-亚麻酸、ARA及DHA的结果均无显著性差异(P>0.05)，表现出了很高的一致性。表6结果还显示，直接甲酯化内标法与国标外标法相比，在测定四种脂肪酸尤其是微量脂肪酸ARA和DHA时，总体表现出了较高的精密度。

2.3 直接甲酯化法对包埋DHA试样的测定

目前市售的乳粉中，很多产品使用包埋DHA原料对DHA的含量进行强化。我们从中国市场包埋DHA原料市场占有率最大的2个原料供应商BASF及Friesland Campina Kievit取得试样，来评价直接甲酯化法测定包埋DHA的性能。表7结果表明，直接甲酯化法可以检测到原料中90%以上的包埋DHA，可以用于含有包埋DHA乳粉样品的检测。

3 结论

本研究在AOAC 2012.13乳粉中脂肪酸检测方法的基础上稍做修改，建立了直接甲酯化法检测乳粉中主要脂肪酸含量的方法。直接甲酯化法表现出了很好的准确性、回收率及精确度。该方法在乳基、豆基、部分水解蛋白及氨基酸配方乳粉中均有很好的适用性，其4种主要脂肪酸的检测结果与GB方法高度一致。并且，此方法对目前中国市场中市场份额占有率较大的2种包埋DHA原料中DHA的检测均适用。本研究的结果表明基于AOAC 2012.13建立的直接甲酯化法具有很好的性能及较广的产品适用性，且操作简单快捷，作为乳粉样品及原料中脂肪酸含量的日常检测方法具有较大的推广潜力及价值。◇

表6 乙酰氯甲醇法及直接甲酯化法测定不同基质乳粉中的亚油酸、α-亚麻酸、ARA及DHA的结果比较

注：a试样S1-S4为乳基婴儿配方粉、S5为含大豆蛋白的较大婴儿配方粉、S6为含部分水解蛋白的婴儿配方粉、S7为氨基酸配方粉。所有试样均为雅培中试试验样品；b4种脂肪酸的测定结果均表示为3次测定的平均值±标准偏差。

表7 直接甲酯化法测定包埋DHA原料中的DHA含量

注：所有结果均表示为g脂肪酸每100g样品。

[1]GB/T 5413.27-2010.Determination of Fatty Acids in Foods for Infants and Young Children，Milk and Milk Products[S]. National Standards of the People’s Republic of China (婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定.中华人民共和国食品安全国家标准).

[2]AOAC Official Method 2012.13.Determination of Labeled Fatty Acids Content in Milk Products and infant Formula Capillary Gas Chromatography[S]. First Action 2012.

[3]Cantellops D，Reid A P，Eitenmiller R R，Long A R.Determination of Lipids in Infant Formula Powder by Direct Extraction Methylation of Lipids and Fatty Acid Methyl Esters(FAME)Analysis by Gas Chromatography[J]. J.AOAC Int.，1999，82(5)：1128-1139.

[4]Certificate of Analysis of Standard Reference Material 1849a[S]. National Institute of Standards & Technology，2012：1-12.

(责任编辑 李婷婷)

Performance of Testing Methods of Fatty Acids in Infant Formula and Adult Nutritional Products

TIAN Fang

(Abbott Nutrition R&D, Shanghai 200233, China)

direct transesterification；acetyl chloride-methanol method；fatty acid；method performance；milk powder；encapsulated DHA

田芳(1985— )，女，博士，分析研究员，研究方向：营养品中营养素及污染物的分析。