microRNA20b调节PPARγ抑制缺氧/复氧诱导的内皮细胞凋亡

卢 悦，王晶晶，梁广彬，胡 喆，张良清,

microRNA20b调节PPARγ抑制缺氧/复氧诱导的内皮细胞凋亡

卢 悦1，王晶晶1，梁广彬1，胡 喆2，张良清1,2

目的:观察microRNA20b对缺氧/复氧诱导内皮细胞凋亡的影响。方法：采用人脐静脉内皮细胞株（HUVECs）建立缺氧/复氧损伤细胞模型。将生长状态良好的HUVECs随机分为正常对照组（Normal组）、缺氧后阴性对照组（HR+NC组）、缺氧后microRNA20b过表达组（HR+20b组）、缺氧后阴性对照抑制组（HR+IN NC组）和缺氧后microRNA20b抑制组（HR+IN 20b组）。缺氧前24 h采用lipofectamine2000将Negative Control、microRNA20b mimics、inhibitor Negative Control、microRNA20b inhibitor分别转染入后四组细胞，然后缺氧培养12 h后复氧4 h。采用免疫荧光检测过氧化物酶体增值物受体γ(PPARγ)蛋白的变化，AnnexinV-FITC/PI流式双染法检测细胞的早晚期凋亡率，Western blot检测PPARγ以及凋亡相关蛋白Bax、抗凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白表达水平。结果：与Normal组相比，缺氧/复氧损伤后各转染组PPARγ蛋白表达升高，凋亡率升高。与HR+NC组相比，HR+20b组的PPARγ及凋亡相关蛋白Bax表达降低、抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达升高，凋亡率降低[(7.70+0.85)%vs(18.20+ 1.05)%,P＜0.05]。与HR+IN NC组相比，HR+IN 20b组的PPARγ及凋亡相关蛋白Bax表达升高、抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达降低，凋亡率升高[(18.9+3.05)%vs(13.0+2.25)%,P＜0.05]。结论：microRNA20b靶向作用于PPARγ抑制缺氧/复氧损伤诱导的内皮细胞凋亡。

microRNA20b；过氧化物酶体增值物受体γ；缺氧/复氧损伤；凋亡

缺血再灌注损伤是临床冠脉搭桥手术、冠脉支架以及心脏移植等常见的病理生理现象[1]。由于目前缺血再灌注损伤的整体动物模型受体内神经、体液的影响，不能确切反映受试药物对损伤组织的保护作用，而体外培养内皮细胞缺氧/复氧损伤是模拟缺血再灌注损伤的有用模型[2-3]。多项研究表明过氧化物酶体增殖物受体γ（peroxisome proliferatorsactivated receptor gamma，PPARγ）可以通过不同途径减轻缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡，缩小缺血再灌注后梗死面积，提示其在这一过程中可能发挥关键作用[4-6]。microRNAs具有在翻译水平调控基因表达的作用。作者前期研究[7]发现，缺氧/复氧损伤内皮细胞会引起microRNA20b等6个microRNAs的显著变化。通过前期生物信息学、双荧光素酶等实验，作者发现microRNA20b与PPARγ之间存在靶向调控关系。但是，microRNA20b是否通过PPARγ影响缺血再灌注所致的细胞凋亡，未见国内外报道。本研究旨在通过体外建立缺氧/复氧损伤细胞模型，观察microRNA20b对缺氧/复氧诱导内皮细胞PPARγ表达及凋亡的影响，探讨microRNA20b在调节PPARγ抑制缺氧/复氧诱导内皮细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 PPARγ（美国CST公司，2443），Bcl-2抗体(英国abcam公司，ab32124)，Bax抗体(英国abcam公司，ab32503)，β-actin(Santa公司，sc-477 78)，兔抗（Earthox，E030120），鼠抗（Earthox,E030110），lipofectamine2000（Invitrogen公司），Trizol（Invitrogen公司，11668027），反转录试剂盒（Takara公司，RR716）, NegativeControl,microRNA20b mimics,inhibitor Negative Control,microRNA20b inhibitor，(苏州吉玛公司)，AnnexinV/PI双染试剂盒（BD公司）。

1.2 细胞培养 取人脐静脉内皮细胞（HUVEC细胞株，广东医科大学附属医院中心实验室提供），复苏后加入含l0%小牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液，接种于培养皿中置于5%CO2、37℃培养箱中培养。每隔2 d换1次培养液，待细胞80%～90%融合时,用0.25%胰蛋白酶消化传代，取3～4代细胞进行实验。

1.3 细胞转染 将生长状态良好的HUVECs随机分为正常对照组（Normal组）、缺氧后阴性对照组（HR+NC组）、缺氧后microRNA20b过表达组（HR+ 20b组）、缺氧后阴性对照抑制组（HR+IN NC组）和缺氧后microRNA20b抑制组（HR+IN 20b组）。Normal组不做处理正常培养，后四组分别外源转入Negative Control 50nM、microRNA20b mimics 50nM、inhibitor Negative Control 100nM、microRNA20b inhibitor 100nM，转染试剂使用 lipofectamine 2000。转染方法：分别使用 Opti-MEM孵育 lipofectamine2000和microRNAs 5min，混合后共同孵育20 min形成络合物后加入细胞中。转染所用的培养基为不含血清和抗生素的培养基，8 h后换成完全培养基。继续有氧环境下培养24 h后，通过实时定量PCR确认转染成功。

1.4 缺氧/复氧细胞模型 细胞转染24 h以后，建立缺氧/复氧细胞模型。缺氧前，将HR+NC组、HR+ 20b组、HR+IN NC组和HR+IN 20b组细胞的完全培养液改为不含糖和血清的培养液，于37℃、5% CO2、95%N2密闭缺氧培养12 h，之后换完全培养基，复常氧培养4 h；Normal组用完全培养基常氧培养相同的时间。

1.5 免疫荧光 将生长状态良好的HUVECs种在铺有22 mm×22 mm盖玻片的六孔板中。待细胞密度达到80%左右，按上述方法对细胞进行转染及缺氧损伤处理。对处理之后的细胞进行染色。对细胞进行固定、打孔、封闭、孵育一抗及荧光二抗后封片，4℃保存。Leica TCS SP5Ⅱ激光扫描共聚焦显微镜，标记每个标本PPARγ的荧光值，并采用IMAGE-PRO PLUS 6.0软件计算100个细胞中PPAR γ小点的平均个数。

1.7 流式细胞术 按上述方法对细胞进行转染及缺氧损伤处理。消化细胞，200 μL缓冲液稀释收集各组细胞，然后各组分别加入5 μLAnnexin-V和5 μL PI进行避光染色，再加入300 μL缓冲液混匀，冰上放置10 min即刻流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.8 Western blot 按上述方法对细胞进行转染及缺氧损伤处理。收集细胞，提取细胞总蛋白质，考马斯亮蓝定量蛋白浓度，70 μg上样，10%SDS-PAGE电泳（60 V/50 min,100 V直到蛋白分离），转膜100 V/ 100 min。封闭1 h,然后使用Bax、Bcl-2、PPARγ及β-actin抗体按1∶1000稀释（稀释液为1%脱脂奶），放于4℃冰箱孵育过夜。二抗1∶10000稀释室温孵育2 h后ECL化学发光法检测相应蛋白的表达情况。

1.9 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PPARγ的表达 与Normal组相比，缺氧/复氧损伤各组PPARγ表达增多；缺氧/复氧损伤后，HR+ 20b组与HR+NC组相比，PPARγ表达明显减少，HR+IN 20b组与HR+IN NC组相比，PPARγ表达明显增多（P＜0.05）。提示microRNA20b可以抑制缺氧/复氧损伤诱导的PPARγ的表达。见图1。

2.2 细胞早晚期凋亡率 Normal组细胞早晚期凋亡率为(3.50±0.85)%，HR+NC组为(18.20±1.05)%，HR+20b组、HR+IN NC组和HR+IN 20b组分别为(7.70±0.85)%、(13.80±2.25)%和(18.90±3.05)%。缺氧/复氧损伤各组与Normal组相比，细胞早晚期凋亡率增加；HR+20b组与HR+NC组相比，凋亡率降低（P＜0.05）；与HR+IN NC组相比，HR+IN 20b组凋亡率升高（P＜0.05）。说明microRNA20b可以抑制缺氧/复氧损伤诱导的细胞凋亡。见图2。

图1 各组细胞缺氧/复氧后PPARγ的表达

2.3 PPARγ、Bax和Bcl-2的表达 与Normal组相比,缺氧/复氧损伤各组PPARγ及凋亡相关蛋白Bax表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量降低；与HR+ NC组相比，HR+20b组PPARγ及凋亡相关蛋白Bax表达降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量升高(P＜0.05)；与HR+IN NC组相比，HR+IN 20b组PPARγ及凋亡相关蛋白Bax表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量降低(P＜0.05)。提示microRNA20b可以抑制缺氧/复氧诱导的PPARγ及凋亡相关蛋白Bax的表达，促进抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达。见图3。

3 讨论

图2 各组细胞凋亡率

业已证实，PPARγ在缺血再灌注损伤的发生发展中扮演重要的角色，因而深入探讨PPARγ的表达调控有助于阐明其在缺血再灌注损伤中的作用及机制。microRNA调节是基因表达调控最为重要的一种调节方式[8-10]。本研究中，作者采用免疫荧光技术分别观察过表达和抑制microRNA20b对缺氧/复氧诱导的PPARγ蛋白表达的影响，结果发现过表达microRNA20b可以减弱PPARγ的表达，而抑制microRNA20b可产生相反的变化，证实microRNA20b对PPARγ的调控作用。microRNA383也可靶向抑制PPARγ保护实验动物前脑缺血损伤，提示PPARγ表达可以受多种microRNAs的调控[11-13]。而研究报道PPARγ可以通过不同途径调控细胞凋亡[14]，那么miroRNA20b是否可以通过调控PPARγ的表达对细胞凋亡产生影响呢？本研究采用流式细胞术观察发现，过表达microRNA20b可以明显的降低缺氧/复氧损伤诱导的细胞早晚期凋亡率，而抑制microRNA20b的表达可以促进细胞凋亡。这些结果提示microRNA20b可能通过PPARγ调节细胞凋亡。

图3 各组凋亡相关蛋白及PPARγ的表达

细胞凋亡是基因控制的细胞自主的程序性死亡，Bcl-2和Bax是凋亡调节基因Bcl-2家族的两个重要成员,二者可通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。Bcl-2/Bax比值升高，抑制细胞凋亡，反之，则促进细胞凋亡。本研究中，外源转入microRNA20b mimics，蛋白免疫印迹结果显示，Bcl-2升高，Bax降低，Bcl-2/Bax比值升高，抑制了细胞凋亡，这与前述实验结果一致，提示microRNA20b是通过影响Bcl-2/Bax而减轻细胞凋亡；而有研究发现[15]沉默PPARγ可以通过上调Bcl-2的表达从而抑制细胞凋亡。本研究中，转染microRNA20b后PPARγ表达降低，Bcl-2升高，Bax降低，再次证实这一现象。由此可见，microRNA20b可能是通过调节PPAR γ影响Bcl-2/Bax复合物来影响细胞凋亡。

[1]Ong SB,Samangouei P,Kalkhoran SB,et al.The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia re⁃ perfusion injury[J].J Mol Cell Cardiol,2015,78:23-34.

[2]Huang Z,Zhong X,Irwin M G,et al.Synergy of isoflurane precon⁃ditioning and propofol postconditioning reduces myocardial reperfu⁃sion injury in patients[J].Clin Sci,2011,121(2):57-69.

[3]Zang WJ,Sun L,Yu XJ,et al.Cardioprotection of ischemic post⁃conditioning and pharmacological post-treatment with adenosine or acetylcholine[J].Acta Physiol Sin,2010,59(5):593-600．

[4]Zingarelli B,Hake PW,Mangeshkar P,et al.Diverse cardioprotec⁃tive signaling mechanisms of peroxisome proliferator-activated re⁃ceptor-gamma ligands,15-deoxy-Delta12,14-prostaglandin J2 and ciglitazone,in reperfusion injury:role of nuclear factor-kap⁃paB,heat shock factor 1,and Akt[J].Shock,2007,28(5):554-563.

[5]Khandoudi N,Delerive P,Berrebi-Bertrand I,et al.Rosiglitazone, a peroxisome proliferator-activated receptor-gamma,inhibits the Jun NH(2)-terminal kinase/activating protein 1 pathway and pro⁃tects the heart from ischemia/reperfusion injury[J].Diabetes,2002, 51(5):1507-1514.

[6]Nakanishi A,Tsukamoto I.n-3 polyunsaturated fatty acids stimu⁃late osteoclastogenesis through PPARγ-mediated enhancement of c-Fos expression,and suppress osteoclastogenesis through PPAR γ-dependent inhibition of NFkB activation[J].J Nutr Biochem, 2015,26(11):1317.

[7]Chen Z,Hu Z,Lu Z,et al.Differential MicroRNA Profiling in a Cellular Hypoxia Reoxygenation Model upon Posthypoxic Propofol Treatment Reveals Alterations in Autophagy Signaling Network[J]. Oxid Med Cell Longev,2013,2013(6):378484-378484.

[8]Ji R,Cheng Y,Yue J,et al.MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of MicroR⁃NA in vascular neointimal lesion formation[J].Circ Res,2009,100: 1579-1588.

[9]Pan W,Zhong Y,Cheng C,et al.MiR-30-regulated autophagy me⁃diates angiotensin II-induced myocardial hypertrophy[J].PLoS One,2013,8:e53950.

[10]Fang YC,Yeh CH.Inhibition of miR-302 Suppresses Hypoxia-Re⁃oxygenation-Induced H9c2 Cardiomyocyte Death by Regulating Mcl-1 Expression[J].Oxid Med Cell Longev,2017,2017:7968905.

[11]Pei L,Meng S,Yu W,et al.Inhibition of MicroRNA-383 Amelio⁃rates Injury After Focal Cerebral Ischemia via Targeting PPARγ [J].Cell Physiol Biochem,2016,39(4):1339.

[12]Yarushkin AA,Kazantseva YA,Kobelev VS,et al.Peroxisome pro⁃liferator-activated receptor γ activation inhibits livergrowth through miR-122-mediated downregulation of cMyc[J].Eur J Phar⁃macol,2017,797:39-44.

[13]Zhang J,Huang Y,Shao H,et al.Grape seed procyanidin B2 in⁃hibits adipogenesis of 3T3-L1 cells by targeting peroxisome prolif⁃erator-activated receptor γ with miR-483-5p involved mechanism [J].Biomed Pharmacother,2017,86:292-296.

[14]Lutzen U,Zhao Y,Lucht K,et al.Activation of the cell membrane angiotensin AT2 receptors in human leiomyosarcoma cells induces differentiation and apoptosis by a PPARγ-dependent mechanism [J].Neoplasma,2017,64(3):395-405.

[15]杨靖宇.沉默PPAR-γ通过上调bcl-2表达抑制A549细胞凋亡[J].中国肺癌杂志,2013,16(3):125-130.

（收稿：2016-12-22 修回：2017-05-18）

（责任编辑 张淑坤 余剑波）

microRNA20b Inhibits Apoptosis induced by Hypoxia/reoxygenation Injury in Endothelial Cells via Nu⁃clear Receptor PPARγ

LU Yue,WANG Jing-jing,LIANG Guang-bin,et al.
Department of Anesthesiology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College and Key Laboratory of Organ Damage and Protection of Zhanji⁃ang City,Zhanjiang(524001),China

Objective To investigate the mechanism of microRNA20b reducing apoptosis induced by hypox⁃ia/reoxygenation injury.MethodsThe hypoxia/reoxygenation model was created use human umbilical vein en⁃dothelial cells(HUVECs).HUVECs were divided into 5 groups randomly as normal control group(Normal group), anoxic Negative Control group(HR+NC group),anoxic microRNA20b mimics group(HR+20b group),anoxic in⁃hibitor Negative Control group(HR+IN NC group)and anoxic microRNA20b inhibitor group(HR+IN 20b group). The last four groups were transfected with Negative control,microRNA20b mimics,inhibitor Negative Control or microRNA20b inhibitor respectively for 24 h.Then the transfected cells were treated with 12 hours hypoxia fol⁃lowed by 4 hours reoxygenation.Immunofluorescence was used to detect the expression of PPARγ.Annex⁃inV-FITC/PI double staining apoptosis detection was used to test the apoptosis rate of HUVECs.The expression of Bax、Bcl-2 and PPARγ were determined by western blot.ResultsThe expression of PPARγ was increased after hypoxia/reoxygenation injury compared with Normal group.Compared to HR+NC group,the expression of PPARγ and the apoptosis-related protein Bax were lower in HR+20b group,but the expression of anti-apopto⁃sis-related protein Bcl-2 was higher.And the apoptosis rate of HR+20b group was lower[(7.70+0.85)%vs (18.20+1.05)%,P＜0.05].Conversely,the cells in HR+IN 20b group expressed higher PPARγ protein and the apoptosis-related protein Bax but lower anti-apoptosis-related protein Bcl-2,also had higher apoptosis rate than HR+IN NC group[(18.9+3.05)%vs(13.0+2.25)%,P＜0.05].ConclusionmicroRNA20b could prevent the hypoxia/reoxygenation injury-induced apoptosis by regulating the expression of PPARγ.

microRNA20b;peroxisome prolif⁃erative activated receptor gamma;hypoxia/reoxygen⁃ation injury;apoptosis

R329.2+5

A

1007-6948(2017)03-0283-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.03.016

国家自然科学基金（81470405）

1.广东医科大学附属医院麻醉科（湛江 524001）

2.广东省湛江市器官功能损伤与保护重点实验室

张良清，E-mail:zhanglq1970@163.com