右美托咪定减轻氧化应激改善H9C2细胞缺氧/复氧损伤

李璟

摘 要：目的 探讨右美托咪定减轻氧化应激改善H9C2细胞缺氧/复氧损伤的作用。方法 H9C2心肌细胞随机分为三组，正常对照组（Control）、缺氧/复氧组（H/R）、Dex（5 μmol/L）干预H/R组。Dex干预H/R组先用Dex预处理6 h后，再经缺氧/复氧处理。检测各组细胞培养基中LDH的含量，CCK-8法检测各组H9C2心肌细胞的存活率，试劑盒检测caspase-3活性，试剂盒检测MDA的含量和SOD活性。结果 与Control组相比，H/R组细胞活力降低，培养基中LDH含量增加，caspase-3活性增加，MDA含量升高而SOD活性降低，统计学意义显著（P<0.01）；Dex预处理提高H/R处理后的细胞活力，减少LDH含量和caspase-3活性，降低MDA含量，增加SOD活性，统计学意义显著（P<0.01）。结论 Dex可通过减轻氧化应激改善H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤。

关键词：右美托咪定；氧化应激；缺氧/复氧；H9C2

中图分类号：R614 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.14.027

文章编号：1006-1959（2018）14-0095-03

Abstract：Objective To investigate the effect of dexmedetomidine on oxidative stress and improvement of hypoxia/reoxygenation injury in H9C2 cells.Methods H9C2 cardiomyocytes were randomly divided into three groups.The normal control group（Control）， hypoxia/reoxygenation group（H/R），and Dex（5μmol/L）were used to intervene in the H/R group.Dex intervention in the H/R group was pretreated with Dex for 6 h and then treated with hypoxia/reoxygenation.The LDH content in the cell culture medium was detected. The survival rate of H9C2 cardiomyocytes in each group was detected by CCK-8 method.The caspase-3 activity was detected in the kit， and the MDA content and SOD activity were detected by the kit.Results Compared with the Control group，the cell viability in the H/R group decreased，the LDH content in the medium increased，the caspase-3 activity increased，the MDA content increased and the SOD activity decreased，statistically significant（P<0.01）；Dex pretreatment improved cell viability after H/R treatment，decreased LDH content and caspase-3 activity，decreased MDA content，and increased SOD activity，with statistical significance（P<0.01）.Conclusion Dex can alleviate hypoxia/reoxygenation injury of H9C2 cardiomyocytes by reducing oxidative stress.

Key words：Dexmedetomidine；Oxidative stress；Hypoxia/Reoxygenation；H9C2

缺血性心肌病（Ischemic cardiomyopathy，ICM）是世界范围内具有高致残率和致死率的疾病，是目前威胁人类生命健康的一类主要疾病[1]。快速有效的实现缺血心肌的血液复流即再灌注，是临床上首选的治疗方法，然而再灌注本身会加重心肌损伤，导致能量代谢障碍，形成心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI）[2-4]。关于MIRI机制的研究集中在钙超载，氧化应激，能量代谢障碍，炎症反应和凋亡、坏死及自噬等方面[5-7]。右美托咪定（dexmedetomidine， Dex）是一种新型的高选择性α2受体激动剂，具有剂量依赖性的镇静、镇痛、抗焦虑和抑制交感神经兴奋等作用，且对呼吸、循环的抑制作用轻微[8]。Dex对心肌的保护作用受到越来越多的关注，普遍认为Dex是通过抑制交感中枢活动，降低心率，降低心肌氧耗，改善心肌氧供需平衡，但具体机制仍未阐明。本研究采用H9C2细胞缺氧/复氧模型，观察Dex预处理减轻氧化应激改善H9C2细胞缺氧/复氧损伤的作用。

1材料与方法

1.1试剂与仪器 H9C2心肌细胞系购买自深圳百恩维公司；盐酸右美托咪定购自江苏恒瑞医药有限公司（200 μg/2 ml）；DMEM培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司；0.25 %胰蛋白酶购自Sigma公司；CCK-8细胞毒性检测试剂盒购自七海生物公司；LDH检测试剂盒，caspase-3活性检测试剂盒，MDA检测试剂盒和SOD检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。超净工作台购自苏州净化设备仪器厂；CO2细胞培养箱购自Thermo公司；低速离心机购自赛特湘仪公司；酶标仪购自SpectraMax公司。

1.2 H9C2心肌细胞的培养和H/R模型的建立 用含10%胎牛血清的DMEM培养液在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育H9C2细胞；H/R模型通过将H9C2细胞正常培养基换为无血清的DMEM并在缺氧箱中处理12 h，之后将无血清的DMEM换成含10%胎牛血清DMEM培养液后放入正常培养箱中孵育4 h。

1.3 实验分組 将H9C2细胞随机分为三组：正常对照组（Control）、缺氧/复氧组（H/R）和右美托咪定干预缺氧/复氧组（Dex+H/R）。Dex+H/R 组先用Dex预处理6 h，再进行H/R处理。

1.4 CCK-8法检测各组细胞活力 各组实验结束后，将培养基倒掉，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，再加入100 μl无血清的培养液和10 μl CCK-8检测液，在37 ℃细胞培养箱中避光孵育2 h，酶标仪检测各孔OD值，波长为450 nm。

1.5 各组细胞培养液中LDH的检测 各组实验结束后，收集每组培养瓶中细胞培养液，严格按照南京建成生物工程研究所提供的检测试剂盒说明书操作，酶标仪检测各孔OD值，波长为450 nm，将各组读数与Control组比较。

1.6 caspase-3试剂盒检测细胞凋亡 各组实验结束后，加入试剂盒提供的裂解液，用细胞刮将各组细胞刮下，冰上裂解20 min，在12000 g离心力下离心15 min，收集上清，-80 ℃保存。严格按照试剂盒的说明，将蛋白样品与底物混匀，37 ℃避光水浴1 h，于405 nm波长下，避光测定荧光底物吸光值。各组caspase-3活性的表示方法为：将对照组的活性设定为1，实验组的caspase-3活性用其吸光值与对照组的比值表示。

1.7 各组细胞培养液中MDA含量和SOD活性的检测 各组实验结束后，收集每组培养瓶中细胞培养液，严格按照南京建成生物工程研究所提供的检测试剂盒说明书操作，酶标仪检测各孔OD值，波长为450 nm，按照说明书的方法将读数换算为MDA和SOD的含量。

1.8统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，实验结果用（x±s）表示，用单因素方差分析比较两组之间的统计学差异，并用Bonferroni法进行校正，P<0.05表示差异有统计学意义， P<0.01表示统计学意义显著。

2结果

2.1 Dex对H/R损伤后H9C2细胞活力和培养基中LDH含量的影响 如图1所示，与Control组相比，H9C2细胞H/R处理后降低了其细胞活力，培养基中LDH含量增加（P<0.01）；而与H/R组相比，H9C2细胞Dex干预H/R细胞活力得到改善，培养基中LDH含量降低（P<0.01）。

2.2 Dex对H/R损伤后H9C2细胞凋亡的影响 如图2所示，与Control组相比，H9C2细胞H/R处理后caspase-3的活性升高（P<0.01）；而与H/R组相比，H9C2细胞Dex干预H/R后caspase-3的活性降低（P<0.01）。

2.3 Dex对H/R损伤后H9C2细胞氧化应激的影响 如图3所示，与Control组相比，H9C2细胞H/R处理后MDA含量升高，SOD活性降低（P<0.01）；与H/R组相比，H9C2细胞Dex干预H/R后MDA含量降低，SOD活性升高（P<0.01）。

3 讨论

心肌再灌注损伤已经成为限制缺血性心脏病患者预后的重要因素，临床上药物溶栓、动脉搭桥术和经皮冠状动脉成形术等的治疗效果也大打折扣。如何有效减轻再灌注损伤一直是心血管研究领域的热点和焦点。Dex作为一种新型的α肾上腺素受体高选择性激动剂，被广泛应用于心血管手术的麻醉，并收到了很好的疗效。

Dex预处理可激活α肾上腺素能受体，减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤。Dex还可能通过抑制mPTP的开放及线粒体ATP敏感性钾通道（mitochondrial ATP-sensitive potassium channel， mitoKATP）的活性减少心肌损伤[9]。本实验结果发现，H/R组H9C2细胞活力显著降低，培养基中LDH含量明显增加，而Dex干预H/R组可显著改善H9C2细胞活力，明显降低培养基中LDH含量；caspase-3是caspase家族中关键的效应分子，其活性增加是线粒体凋亡发生的重要标志[10]。同时，H/R组H9C2细胞caspase-3活性明显增加，而Dex干预H/R组可显著减少H9C2细胞凋亡，以上结果均说明Dex可减轻H9C2细胞H/R损伤。

氧化应激是导致心肌缺血-再灌注损伤的一个重要原因。本研究中发现，H/R组H9C2细胞MDA含量明显增加，SOD活性显著降低，而Dex干预H/R组可显著降低H9C2细胞MDA含量，增加SOD活性，这些结果说明Dex可通过降低氧化应激改善H9C2细胞H/R损伤。

综上所述，本研究证实Dex可通过降低氧化应激减少细胞凋亡减轻心肌细胞缺血/再灌注损伤，发挥重要的心血管保护作用。本研究为临床上应用Dex作为防治围术期心血管疾病提供了实验依据。

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收稿日期：2018-4-25；修回日期：2018-5-4

編辑/李桦