YebF作为载体蛋白所引导的重组蛋白胞外分泌表达途径的研究进展

郑晓芳，赵 敏

(东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040)



YebF作为载体蛋白所引导的重组蛋白胞外分泌表达途径的研究进展

郑晓芳，赵 敏*

(东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主菌之一，但是由于它大多将重组蛋白分泌到菌体内部，导致重组蛋白不能正确折叠或者被降解而失去活性，使得目的蛋白的提取和纯化过程较为繁琐。解决这些问题的方法之一就是将重组蛋白分泌到胞外培养基中，这样不仅有利于蛋白的正确折叠，也会极大地简化目的蛋白的提取和纯化过程。近年发现的YebF蛋白是由大肠杆菌分泌到胞外培养基中的可溶内源性短肽，大小为10.8 kDa；虽然其功能未知，但是YebF可作为载体蛋白与重组蛋白融合从而引导异源蛋白的胞外分泌表达。综述了YebF蛋白的结构及其胞外分泌表达的机理，总结了应用YebF分泌途径成功胞外表达异源蛋白的例子，阐述了利用YebF胞外分泌途径提高目的蛋白表达量的策略，为更多重组蛋白的高效分泌表达提供了理论基础。

YebF蛋白；载体蛋白；重组蛋白；胞外分泌表达；高效分泌策略

1 大肠杆菌分泌途径

大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主菌之一[1]，具有遗传背景清楚、操作简单、生长周期短、成本低、易实现大规模高密度发酵等优点[2]，利用大肠杆菌分泌途径胞外表达重组蛋白具有可促进蛋白正确折叠、提高蛋白稳定性及可溶性、简化纯化工序、降低生产成本等诸多优势[3]，备受关注和青睐。

目前在G-细菌中已经发现并研究得较为成熟的蛋白分泌途径有6种[4]，其中最主要的是大肠杆菌分泌途径，表达重组蛋白应用最广泛的分泌途径为Ⅰ型和Ⅱ型系统[5]。其中Ⅰ型分泌系统也称α-溶血素(HlyA)分泌系统，运输底物HlyA通过HlyB、HlyD和TolC形成的连通周质与胞外的跨膜通道直接从胞内释放到胞外，整个反应为单步反应，底物无需穿越两层膜[6]；Ⅱ型分泌系统是以细胞周质为中介的两步跨膜运输过程：蛋白先经SecB依赖性途径、信号识别颗粒途径(SRP)或双精氨酸转运途径(TAT)，通过细胞内膜转运至大肠杆菌周质空间内，随后经不同的转运体或渗透性作用分泌到胞外[5]。

虽然大肠杆菌分泌途径有诸多优点，但大部分目的蛋白都被分泌在菌体内，需通过细胞破碎或渗透性失水作用处理菌体细胞，极易造成目的蛋白失活或流失，且大肠杆菌细胞内蛋白组分复杂，破胞后会和目的蛋白一同释放到缓冲液中，不利于后续目的蛋白的纯化。解决这些问题的最有效方法之一是大肠杆菌直接将重组蛋白释放到胞外培养基中，这一策略有诸多优点[7-9]：第一，简化了重组蛋白的纯化程序。所需重组蛋白在培养基上清液中，直接离心即可获得，无需破胞处理，且大肠杆菌自身分泌到胞外的背景蛋白很少，有效简化了目的蛋白的纯化步骤；第二，提高了重组蛋白的生物学活性，减少了包涵体的产生。重组蛋白在分泌过程中会经过周质空间，将重组蛋白暴露在一系列的二硫键异构酶和折叠酶中，从而促进重组蛋白的正确折叠和二硫键的形成，减少包涵体的产生；第三，增强了重组蛋白的稳定性和溶解性。除了分子伴侣之外，周质和胞外基质中只有很少的蛋白酶，因此减少了重组蛋白的降解，增强了重组蛋白的稳定性和溶解性。

通常认为只有病原性的大肠杆菌可以将蛋白释放到外部环境中[10]，非致病性的实验室大肠杆菌特别是EscherichiacoliK12菌株缺少相应的蛋白分泌系统，因此在正常生长条件下不能将蛋白分泌到胞外培养基中[11-12]，但是YebF蛋白的发现打破了这一观点。

2 YebF分泌途径

2.1 YebF蛋白简介

YebF蛋白广泛存在于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌中，是由大肠杆菌分泌到胞外培养基中的可溶内源性短肽，大小为10.8 kDa。虽然其功能未知，但是YebF可作为载体蛋白与重组蛋白融合从而引导异源蛋白的胞外分泌表达[13]。目前对YebF蛋白的研究不多，其分泌途径更是少之又少。

2.2 YebF蛋白结构

Prehna等[14]对YebF蛋白的结构(图1)进行了研究，通过动态光散射实验证明YebF蛋白在溶液中是以单体的形式存在，其结构包括一个有序的结构核心(ordered structured core)和一个扩展的动态表面(extensive dynamic surface)。Dali Server蛋白数据库[15]比对发现结构核心类似于胱抑素蛋白家族，由47个氨基酸残基组成，这些氨基酸残基折叠成一个紧凑的结构域，由一个二硫键(C35-C108)稳定结构；结构核心的二级结构包括1个4-转角α-螺旋(4-turnα-helix,α1)、4个反向平行的β-折叠(β-strands)和1个1-转角310螺旋(single turn of 310helix)；动态表面包括2个区域：动态环1(dynamic loop 1)和动态环2 (dynamic loop 2)。15N异核单量子相关谱(15N-HSQC)显示动态环1和动态环2的氨基酸残基会发生构象改变。这种现象在那些处于灵活运动状态的蛋白质中很常见，构象的改变对于蛋白质的生物学功能起到决定性作用[16]。

图1 YebF蛋白的结构

YebF蛋白的结构核心类似于大肠杆菌素M免疫蛋白(colicin M immunity protein，Cmi)，序列比对有高度的一致性[14,17]。类似的结果也在Gerard等[18]的研究中发现，在90多个氨基酸残基的序列比对中，Cmi与YebF有26%(E.coliYebF)到35%(Yersiniaspecies YebF)的序列一致性，Cmi的晶体结构中构成二硫键的2个半胱氨酸残基在所有的YebF序列中都是高度保守的。但是与YebF不同，Cmi被它的N末端固定在内膜的周质面，通过与大肠杆菌素M结合，达到保护细菌的目的[18]。此外，Cmi的N末端有一个5个氨基酸残基的缺失和一个3个氨基酸残基的内部插入，导致了Cmi二硫键的位置与YebF二硫键的位置不同[14]。

通过ConSurf Server[19]和PSI-BLAST(position-specific iterated BLAST)[20]分析发现，YebF蛋白的保守区域是动态表面而非结构核心，且其保守性最高的区域为动态环1和动态环2。与之不同的是，除了对于正确折叠不可或缺的二硫键和疏水性氨基酸残基序列比较保守外，YebF蛋白的结构核心序列因菌株种类的不同而存在差异。

由泊松-玻尔兹曼方程(Adaptive Poisson-Boltzmann Solver，APBS)[21]发现，YebF蛋白分子的表面由2种相反的电极组成，阳性面包括α1 折叠面和2个动力环，阴性面是YebF结构核心区域的外部反向平行β-折叠面[14]。

2.3 YebF胞外分泌机制

通过基因工程技术研究发现，YebF蛋白的胞外释放不是由于细胞的凋亡和细胞膜的渗漏，而是蛋白分泌表达的结果[13]。Seo等[22]通过YebF蛋白与β-防御素2(HBD2)融合在重组E.coliNissle 1917菌株中的胞外释放也得到了相同的结论。YebF蛋白的分泌是通过2个步骤实现的，但是其蛋白转运机制却不同于目前已知的6种分泌途径[13-14]。

2.3.1 外膜孔蛋白与YebF胞外分泌关系

Prehna等[14]运用基因、生物化学和生物物理学技术研究了YebF蛋白独特的外膜转运机制，通过基因删除、基因互补实验以及平面脂双层实验研究外膜孔蛋白OmpF、OmpC和OmpX与YebF胞外分泌的关系。结果发现，OmpF和OmpX是YebF胞外分泌所必需的元件，虽然OmpC参与了YebF胞外分泌过程，但不是必须的；OmpF是外膜上含量最丰富的蛋白之一[23-24]，是胞外毒素蛋白进入周质的通道[25]；OmpF和OmpC可以形成异三聚体OmpF/C[26]，OmpC作为附属元件可以加强YebF蛋白与异三聚体OmpF/C的相互作用；OmpF和OmpC可以形成大小可变的阴性通道来转运小的可溶性代谢分子[23]，也可以摄取大的毒素蛋白进入细胞中[25]。平面脂双层实验证明YebF蛋白与OmpF/C的相互作用发生在外膜的周质面，并且YebF蛋白的某一区域可能插入到OmpF的内腔[14]，这一现象类似于大肠杆菌素E3[24]和E9[27](在分泌过程中，E3和E9无序的N末端中83个氨基酸残基插入到OmpF的内腔)。OmpX是一大小为17 kDa、β-折叠的外膜蛋白，它可以促进宿主细胞的粘附[28]。Prehna等[14]研究表明，OmpX的作用可能是帮助YebF蛋白定位和组装到OmpF/C上。

2.3.2 YebF蛋白结构元件与其胞外分泌的关系

鉴于大肠杆菌素特有的结构对于其孔蛋白介导的摄取过程起关键性作用[25]，Prehna等[14]通过NMR和基因突变技术研究了YebF蛋白的结构元件与其孔蛋白介导的分泌途径之间的关系。YebF蛋白表面是由2种相反的电极组成，这种静电学结构表明YebF蛋白很可能与大肠杆菌素E9相似[27]，通过阳极和阴极交替的蛋白片段插入到OmpF的内腔。此外，二硫键(C35-C108)的突变导致在胞外培养基中检测不到YebF蛋白，2个动态环的突变导致YebF胞外分泌量与野生型的相比减少了80%以上。YebF蛋白可以与二硫键体系(disulfide bond，Dsb)中的组分(DsbA、DsbC和DsbD)相互作用，并且DsbC(二硫键异构酶)的缺失会导致大肠杆菌中4种周质蛋白(MepA、End1、Ivy和YebF[29])的含量明显减少。DsbC的作用是使二硫键异构化，也可以纠正周质中被二硫键氧化酶错误氧化的二硫键[29-30]。因此二硫键的异构化在YebF胞外分泌途径中是必不可少的。通过质谱分析发现YebF蛋白整体是静止的，只有N末端和动态环区域以纳秒-微秒的时间轴剧烈运动，进行快速的构象变化。此外，YebF蛋白结构中的2个动态环区域为阳性电极，胱抑素核心区域为阴性电极。这表明YebF是一个具有2个相反电极的蛋白分子，一面是灵活无序的，另一面是静止有序的。

平面脂双层实验证明YebF蛋白在分泌过程中会识别OmpF/C的周质面，并且这种相互作用会被YebF蛋白的阳性动态环区域、OmpF/C的阴性周质面所加强。有研究表明蛋白的灵活性可以作为一种生物识别的途径[31]，实验数据也显示动态环区域的突变会导致YebF胞外分泌量大大减少。综合表明，YebF蛋白的动态特性对于其分泌是很重要的，可能通过促进YebF蛋白与外膜蛋白的静电作用来促进YebF蛋白的分泌[14]。

2.3.3 YebF胞外分泌机制

Prehna等[14]通过研究外膜孔蛋白和YebF蛋白结构元件与YebF胞外分泌的关系，总结了外膜孔蛋白介导的YebF胞外分泌机制。YebF胞外分泌途径分为两步：首先preYebF蛋白(13 kDa)在细胞质中合成后通过内膜上的Sec途径转运到周质中，在周质中被前导肽酶Ⅰ切割成成熟的YebF蛋白(10.8 kDa)；然后在周质中通过识别外膜上的OmpX蛋白将YebF蛋白定位到外膜上，具体是通过OmpX的介导和YebF蛋白的阳性动态面的帮助，将YebF蛋白组装到外膜阴性周质面的OmpC上，以此与OmpF/C结合；定位到外膜上后，YebF蛋白的无序快速运动的N末端会插入到OmpF的内腔，然后通过孔蛋白形成的通道分泌到胞外培养基中。在这个过程中YebF蛋白是线性的无折叠的状态，因此推测YebF蛋白在被分泌到胞外培养基的时候，被重新折叠[14]。

2.4 YebF所引导的重组蛋白胞外分泌表达途径的应用

YebF可以作为载体蛋白引导不同大小和形状的原核和真核重组蛋白分泌到胞外培养基中，并保持重组蛋白的活性状态不变[13]。已有很多蛋白通过YebF分泌途径成功在胞外培养基中得到表达。表1是通过融合YebF蛋白成功实现重组蛋白胞外分泌表达的实例。

表1 融合YebF蛋白成功实现重组蛋白胞外分泌表达的实例Tab.1 Examples of recombinant proteins extracellular secretory expression fused to protein YebF

3 提高重组蛋白胞外积累量的策略

虽然通过YebF分泌途径实现了重组蛋白成功分泌到胞外培养基中，但是目的蛋白的分泌效率很低，例如由YebF分泌途径实现的CotA漆酶的分泌效率只有29%[9]，有些蛋白的分泌甚至受到阻碍，例如γ-干扰素[7]。目的蛋白不能高效表达，这一缺点大大限制了YebF分泌途径更广泛的应用。因此需要采取一些策略提高目的蛋白的分泌表达，以扩大YebF分泌途径的应用。

影响蛋白分泌量的因素有很多，总结起来主要有3个：目的蛋白基因水平、分泌表达元件和培养条件。

3.1 目的蛋白基因水平优化

通过在基因水平对表达载体进行改造，一般都是选择强启动子以提高目的蛋白的表达量；此外，就是通过筛选突变菌株来提高重组蛋白的分泌量。

Haitjema等[33]利用基因工程技术构建了一个可以直接筛选高效分泌重组蛋白菌株的工具。其原理为将FlAsH识别序列-四半胱氨酸基序与YebF蛋白的C末端融合，被表达后分泌到胞外与含有双砷基团的有机小分子FlAsH-EDT2特异结合，生成共价结合的双砷染料-半胱氨酸体系，产生荧光，通过检测胞外培养基中荧光强度来达到筛选的目的。通过这种方法发现，单一敲除E.coliBW25113菌株中以下任一基因：entC、entE、envZ、mzrA、nlpD、ompR、tnaA和yihF，都会使YebF蛋白的分泌量提高3倍；敲除两个及以上基因会使YebF蛋白分泌量更高。这些突变菌株会使与YebF蛋白融合表达的Cel3A、Cel5B、Cel6A和Cel9A分泌量增加，在ΔnlpD、ΔentE和ΔtnaA3种突变菌株中同时共表达这4种蛋白，会使其分泌量提高25%～50%。这种筛选方法同样适用于其它分泌途径[33]。

3.2 分泌表达元件的影响

信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链，因此在重组蛋白的分泌表达过程中起着很重要的作用。可以通过加强信号肽的作用来促进分泌。Broedel等[7]发现，将YebF蛋白的信号肽序列换成SEC(OmpA)或SRP(DsbA)的信号肽序列会使YebF蛋白的分泌量分别提高46倍和35倍。

3.3 培养条件的优化

在诱导目的蛋白表达过程中，诱导条件如诱导时间、温度、IPTG 浓度、转速和培养方式等都会影响蛋白的分泌量。重组蛋白不同，其最适培养条件也不同，这其中的特征及规律需进一步探索[35]。

IPTG作为最常用的诱导剂可以诱导重组蛋白的表达，同时它也是一种细胞毒性物质，浓度过高会抑制细胞的生长。例如，50 μmol·L-1IPTG可正常诱导α-淀粉酶和碱性磷酸酶的分泌表达，当IPTG浓度达到0.1 mmol·L-1时，蛋白表达量就会降低[7]。Low 等[36]指出TB培养基的某些成分有利于蛋白分泌，因此可选择 TB 代替 LB 来培养菌株。也可以用自诱导培养基[37]代替LB培养基，因为自诱导培养基可以短期内实现菌体的高密度生长，缩短重组蛋白的分泌时间同时提高分泌量，并且不需要加诱导剂。研究表明与摇瓶培养比较，生物反应器条件下蛋白的活性及生长量相对较高[38]。Broedel等[7]也发现，相比于在摇瓶中诱导α-淀粉酶和碱性磷酸酶(表达量为20～50 mg·L-1)，条件优化后的大规模发酵会使表达量达到100 mg·L-1以上。

4 展望

YebF分泌途径因其可直接将重组蛋白分泌到胞外培养基中，大大简化了重组蛋白的提取和纯化过程，近几年备受关注。特别是对于在大肠杆菌中重组表达的药物蛋白，该途径极大地减少了在收集和纯化过程中脂多糖对药物蛋白的污染。虽然参与YebF分泌途径的几个元件已经被发现，但是各个元件在分泌过程中与YebF蛋白的相互关系以及完整的分泌途径仍需更进一步的研究。二硫键及二硫键体系中DsbA、DsbC和DsbD在YebF分泌途径中的功能也需要进一步的探讨。是否有其它因子如外膜脂质参与分泌过程，或者是否有其它途径也介导YebF蛋白的分泌，需要更深入的研究。虽然很多重组蛋白都通过YebF分泌途径被成功分泌到胞外，但是分泌效率很低，严重限制了该途径大规模产业化应用。因此，如何提高YebF途径的分泌效率是未来努力的方向。随着对YebF分泌途径机制的深入认识和高效分泌重组蛋白技术的提高，YebF分泌途径的应用范围会更广，各种药物蛋白及酶类产品产业化前景会更广阔。

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Research Progress in Extracellular Secretory Expression Pathway of Recombinant Protein Fused to the Carrier Protein YebF

ZHENG Xiao-fang,ZHAO Min*

(CollegeofLifeSciences,NortheastForestryUniversity,Harbin150040,China)

AlthoughEscherichia coliisoneofthemostwidely-usedhostsfortheexpressionofrecombinantprotein,severallimitationsremainbecauseofintracellularsecretoryexpressionofrecombinantprotein,thusrecombinantproteincannotbefoldedcorrectlyordegradedtoloseactivity,andtheextractionandpurificationofdesiredproteinwillbegreatlycomplicated.Onewaytosolvetheseproblemsistosecreterecombinantproteinintoanextracellularmedium,whichismoreconductivetofoldcorrectly,andgreatlysimplifiestheextractionandpurificationprocess.RecentinvestigationshaveshownthattheproteinYebFsecretedintotheextracellularmediumbyE.coliisasmall(10.8kDainthenativeform)andsolubleendogenousshort-peptide.ThefunctionofproteinYebFisunknown,butitcanactasacarrierproteintofusetherecombinantproteinintotheextracellularmedium.ThestructuresandtheextracellularsecretoryexpressionmechanismofproteinYebFarereviewed.TheapplicationsofproteinYebFtocoexpressrecombinantproteinsintotheextracellularmediumaresummarized.Besides,thestrategyforenhancingtheexpressionandsecretionlevelofdesiredproteinsisexplained,whichprovidesatheoreticalbasisfortheefficientsecretoryexpressionofmorerecombinantproteins.

proteinYebF;carrierprotein;recombinantprotein;extracellularsecretoryexpression;efficientsecretorystrategy

国家林业局948项目(2012-4-03)，国家重点基础研究发展计划项目(2014FY210400)，中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572014AA05)

2017-01-04

郑晓芳(1990-)，女，河南濮阳人，硕士研究生，研究方向：漆酶的胞外诱导表达和固定化，E-mail：18745029415@163.com；通讯作者：赵敏，教授，E-mail：82191513@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.06.002

Q786 Q51

A

1672-5425(2017)06-0006-06

郑晓芳，赵敏.YebF作为载体蛋白所引导的重组蛋白胞外分泌表达途径的研究进展[J].化学与生物工程，2017，34(6)：6-11.