海洋放线菌AM8发酵条件的优化及抑菌活性物质的初步研究

张 莉，倪孟祥

(中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 210009)



海洋放线菌AM8发酵条件的优化及抑菌活性物质的初步研究

张 莉，倪孟祥*

(中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 210009)

以海洋放线菌AM8发酵液抑菌物质的活性为评价指标，采用单因素实验对海洋放线菌AM8的基础发酵培养基和发酵条件进行优化，并对抑菌活性物质进行了初步研究。确定最佳培养基为：胰蛋白胨17 g·L-1，大豆胨3 g·L-1，蔗糖2.5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，K2HPO42.5 g·L-1，海盐20 g·L-1；最佳发酵条件为：pH值7，温度28 ℃，接种量5%，转速200 r·min-1，发酵时间5 d。该抑菌活性物质为中等极性物质，具有良好的耐酸性和一定的热稳定性，在强碱、高温环境下易失活。

放线菌AM8；发酵条件；优化；抑菌活性物质

自Waksmanfa发现链霉菌以来，以抗生素生产、研究为首的现代技术产业迅速发展。但由于传统陆生来源的抗菌微生物和抗生素的大量重复分离，极大阻碍了寻求新型有效生物活性物质的进程[1]。随着广泛筛选和活性物质的重复发现，以及近年来临床病原微生物和耐药病原菌数量的急剧增加，迫切需要我们开发新型有效的抗生素。

海洋是生命的起源，蕴藏全球80%以上的物种，是包括未培养微生物在内的珍贵宝库[2]。海洋具有复杂多样的生态环境，海洋微生物相对于土壤微生物，更能耐受高压、高盐、低光照、低氧等特殊生存条件，具有遗传、种类及生态功能的多样性，是目前新型微生物及活性化合物的重要来源[3-4]。最新药物发现趋势显示，海洋极端环境可能存在产生特有代谢产物的放线菌群，是开发结构新颖的微生物天然产物的潜力来源。目前已有2/3左右的活性物质在海洋放线菌中被发现，而80%活性物质分离自海洋链霉菌，其分子结构独特新颖，化学结构丰富多样，是土壤链霉菌所不具有的[5-6]。海洋放线菌是海洋微生物中研究最多的群体，已被广泛应用于医药、食品、农业、化工、能源再生、污染治理等领域[7-8]。近年来关于海洋放线菌为新的天然产物的报道逐渐增多，并且有些化合物已进入临床试验阶段[9]，开发海洋放线菌资源、寻找新型活性化合物成为当前研究的热点[10-11]。海洋放线菌AM8发酵液的抑菌活性较强且抗菌谱较广。

海洋放线菌AM8发酵液对耐药菌：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus epidermidis，MRSE)的抑制效果显著，对革兰氏阳性细菌(gram-positivebacteria，G+)：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的抑制效果明显，对革兰氏阴性细菌(gram-negativebacteria，G-)：大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的抑制作用较弱，但表现出一定的抗黑曲霉(Aspergillus niger)活性。鉴于海洋放线菌AM8次级代谢产物较高的抑菌活性，为提高海洋放线菌AM8次级代谢产物的产率，有必要对该菌株的发酵条件进行优化，为后续次级代谢产物的分离、纯化和结构鉴定积累足够的化合物。作者以海洋放线菌AM8发酵液抑菌活性物质对MRSA的抑制效果为评价指标，优化基础发酵培养基和发酵条件，初步研究抑菌活性物质，以提高菌株产活性物质的产率。

1 实验

1.1 菌种

海洋放线菌AM8(从海泥中分离筛选获得)、MRSA，均保藏于中国药科大学生命科学与技术学院微生物制药教研室。

1.2 仪器

Allegra 25R 型高速冷冻离心机，美国Beckman公司；电子分析天平，上海精密科学仪器有限公司；BXM-30R型压力蒸汽灭菌锅、SW-CJ-2FD型超净工作台，上海博讯实业有限医疗设备厂 ；QHZ-98A型全温振荡培养箱，太仓华美生化仪器厂；GHX-9080B-1型隔水式恒温培养箱，上海福玛实验设备有限公司；HH-S11.2型恒温水浴锅，江苏东台电器厂。

1.3 培养基

种子液体培养基(高氏一号液体培养基)(g·L-1)：可溶性淀粉20，KNO31，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，NaCl 0.5，FeSO4·7H2O 0.01。固体培养基添加琼脂20。

基础发酵培养基：

培养基A(g·L-1)：黄豆粉25，可溶性淀粉20，(NH4)2SO42，NaCl 2，K2HPO40.5，CaCO35，海盐20，pH值7.2。

培养基B(g·L-1)：胰蛋白胨17，大豆胨3，葡萄糖2.5，NaCl 5，K2HPO42.5，海盐20，pH值7.1～7.5。

培养基C(g·L-1)：蛋白胨15，黄豆粉5，可溶性淀粉15，甘油1.5，CaCO32，海盐20，pH值7.8。

培养基D(g·L-1)：葡萄糖10，蛋白胨3，小米10，NaCl 2.5，CaCO32，海盐20，pH值7.2～7.4。

培养基E(g·L-1)：葡萄糖4，酵母提取物4，麦芽提取物10，CaCO32，海盐20，pH值7.2。

培养基F(g·L-1)：可溶性淀粉20，K2HPO40.5，KNO31，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，NaCl 0.5，酵母粉5，海盐20，pH值7.4～7.6。

指示菌培养基(g·L-1)：酪蛋白水解物17.5，淀粉1.5，牛肉浸粉5，琼脂20，pH值7.2。

1.4 方法

1.4.1 发酵液的制备

将甘油管保存的海洋放线菌AM8接种到高氏一号固体培养基上，放入28 ℃培养箱中恒温培养7 d。挑取单菌落接种于装有50 mL种子液体培养基的150 mL三角瓶中，于28 ℃、200 r·min-1摇床振荡培养3 d，即得种子液(期间可不断接种以获取新的种子液)。按1%的接种量将种子液接种于装有150 mL基础发酵培养基的500 mL三角瓶中，于28 ℃、200 r·min-1摇床振荡培养5 d，收集滤液，即得发酵液。

1.4.2 抑菌活性的测定

取生长24 h的MRSA斜面，用2 mL生理盐水悬浮，取20 μL菌悬液加入新鲜配制保温于45 ℃恒温水浴的25 mL指示菌培养基中，其浓度约为1×106CFU·mL-1。离心，取上清液用无菌的0.22 μm微孔滤膜过滤，以MRSA为指示菌，采用管碟法测定抑菌物质的活性。加入量为150 μL，37 ℃培养24 h，每组实验平行测3次，以每组抑菌圈直径的平均值作为抑菌活性评价指标。

1.4.3 基础发酵培养基的筛选

将种子液按1%的接种量分别接入基础发酵培养基A～F，于28 ℃、200 r·min-1摇床振荡培养5 d。收集各发酵液于8 000 r·min-1离心20 min，得发酵上清液，测定抑菌活性。

1.4.4 培养基成分的筛选

采用单因素实验分别对基础发酵培养基的碳源、氮源、无机盐进行筛选。于28 ℃、200 r·min-1摇床振荡培养5 d，过滤，收集滤液测定抑菌活性。

1.4.5 发酵条件的筛选

将种子液按1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的接种量接入到装有优化培养基的三角瓶中，分别调节其初始pH值为4、5、6、7、8、9，于28 ℃、200 r·min-1摇床振荡培养5 d，过滤，收集滤液测定抑菌活性。

1.4.6 发酵液抑菌活性物质热稳定性及酸碱稳定性的测定

取120 mL发酵上清液，平均分成12份，分别调节pH值为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，再将各份五等分置于5 mL EP管中，分别置于4 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴2 h，观察抑菌圈产生情况，测量抑菌圈直径。

1.4.7 发酵液抑菌活性物质极性的测定

取120 mL发酵上清液，平均分成12份，分别调节pH值为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，再将各份五等分置于5 mL EP管中，分别加入等体积的正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、石油醚，并编号。于4 ℃静置至完全分层后分别取有机相与水相(pH值调回中性)，以原发酵上清液为对照、以MRSA为指示菌进行抑菌活性的测定，观察有机相与水相的抑菌圈产生情况，测量抑菌圈直径。

2 结果与讨论

2.1 基础发酵培养基的筛选(图1)

图1 不同基础发酵培养基对发酵液抑菌活性的影响

由图1可以看出，在培养基B中发酵液的抑菌圈直径最大，抑菌活性最高。因此，选择培养基B作为海洋放线菌AM8的基础发酵培养基进行接下来的优化实验。

2.2 基础发酵培养基碳源、氮源、无机盐的筛选

2.2.1 碳源的筛选

以原培养基中的葡萄糖作为对照，分别考察蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、木糖、可溶性淀粉、甘油对发酵液抑菌活性的影响，结果见图2。

图2 碳源对发酵液抑菌活性的影响

由图2可以看出，以蔗糖为碳源时，发酵液的抑菌圈直径最大，抑菌活性最高，其次是葡萄糖、乳糖和甘露醇，木糖最低。因此，选择蔗糖作为碳源。

2.2.2 氮源的筛选

以原培养基中的复合氮源胰蛋白胨+大豆胨作为对照，分别考察NaNO3、胰蛋白胨、大豆胨、NH4Cl、尿素、蛋白胨、酵母粉、黄豆粉对发酵液抑菌活性的影响，结果见图3。

图3 氮源对发酵液抑菌活性的影响

由图3可以看出，以原复合氮源胰蛋白胨+大豆胨为氮源时，发酵液的抑菌圈直径最大，抑菌活性最高，其次是NaNO3，海洋放线菌AM8几乎不能利用尿素和酵母粉。因此，选择原复合氮源胰蛋白胨+大豆胨。2.2.3 无机盐的筛选

以原培养基中的复合无机盐NaCl+K2HPO4作为对照，分别考察MgSO4·7H2O、K2HPO4、NaCl、FeSO4·7H2O、CaCO3对发酵液抑菌活性的影响，结果见图4。

图4 无机盐对发酵液抑菌活性的影响

由图4可以看出，添加等量的不同无机盐对发酵液抑菌活性的影响不大，5种无机盐所培养的菌株的发酵液抑菌活性都比较高，其中原复合无机盐的抑菌活性相对最高。因此，选择原复合无机盐NaCl+K2HPO4。

2.3 发酵条件的筛选

2.3.1 接种量对发酵液抑菌活性的影响(图5)

图5 接种量对发酵液抑菌活性的影响

由图5可以看出，接种量对发酵液抑菌活性的影响呈一定的规律，接种量过少或过多都会影响抑菌活性物质的产生；接种量为5%时，发酵液的抑菌圈直径最大，抑菌活性最高。因此，选择接种量为5%。

2.3.2 pH值对发酵液抑菌活性的影响(图6)

图6 pH值对发酵液抑菌活性的影响

由图6可以看出，pH值为7时发酵液的抑菌圈直径最大，抑菌活性最高；pH值为8时抑菌活性有所下降。因此，在发酵时应保证发酵液的pH值为中性，过酸或过碱都不利于抑菌活性物质的积累。

2.4 发酵液抑菌活性物质的研究

2.4.1 抑菌活性物质的热稳定性及酸碱稳定性(图7)

图7 抑菌活性物质的热稳定性及酸碱稳定性

由图7可以看出，发酵液抑菌活性物质在偏酸性条件下活性较高且稳定，由于不同pH值的水溶液对照均无抑菌圈产生，所以排除pH值本身不同造成的影响。在偏酸性条件下，经过60 ℃以下处理的发酵液抑菌活性相差不大，但是经过80 ℃以上处理后抑菌活性明显降低。因此，强碱、高温条件容易导致发酵液抑菌活性物质失活。

2.4.2 抑菌活性物质的极性(图8)

图8 不同萃取剂在不同pH值下萃取的有机相的抑菌活性

由图8可以看出，石油醚和正丁醇萃取后的有机相的抑菌圈直径重合于横坐标轴，说明发酵液抑菌活性物质不溶于石油醚和正丁醇；抑菌活性物质在二氯甲烷、氯仿和乙酸乙酯中有一定的溶解性，但其抑菌活性均低于原发酵液，说明有机溶剂萃取法提取活性物质会造成一定的损失。

实验发现，乙酸乙酯、二氯甲烷和氯仿萃取后的水相仍有一定的抑菌活性，这是因为实验过程只萃取一次，会存在明显的萃取不完全的情况；石油醚和正丁醇萃取后的水相抑菌活性均较高，进一步验证了抑菌活性物质不溶于石油醚和正丁醇，说明该物质为中等极性；在强碱条件下不易溶于有机溶剂，说明该物质在强碱条件下不稳定，易被降解。

3 结论

对海洋放线菌AM8的基础发酵培养基和发酵条件进行优化，并对抑菌活性物质进行初步研究。确定最佳培养基为：胰蛋白胨17 g·L-1，大豆胨3 g·L-1，蔗糖2.5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，K2HPO42.5 g·L-1，海盐20 g·L-1；最佳发酵条件为：pH值7，温度28 ℃，接种量5%，转速200 r·min-1，发酵时间5 d。该抑菌活性物质为中等极性物质，具有良好的耐酸

性和一定的热稳定性，在强碱、高温环境下易失活。该研究为进一步研究海洋放线菌AM8次级代谢产物奠定了理论基础。

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《化学与生物工程》编辑部

Optimization on Fermentation Conditions of MarineActinomyceteAM8 and Preliminary Study on Antibacterial Active Substance

ZHANG Li,NI Meng-xiang*

(CollegeofLifeScienceandTechnology,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)

UsingtheactivityofantibacterialsubstanceofthefermentationbrothfrommarineActinomyceteAM8asanindex，asinglefactorexperimentwasusedtooptimizethebasicfermentationculturemediumandfermentationconditions.Theantibacterialactivesubstanceofthefermentationbrothwaspreliminarilystudied.Theoptimalculturemediumwasasfollows:tryptone17g·L-1,soybeanpeptone3g·L-1,sucrose2.5g·L-1,NaCl5g·L-1,K2HPO42.5g·L-1,andseacrystal20g·L-1.Theoptimalfermentationconditionswereasfollows:pHvalue7,temperature28 ℃,inoculum5%,shakingspeed200r·min-1,andfermentationtime5d.Theantibacterialactivesubstancewasmediumpolaritysubstance,whichhadgoodacidresistanceandcertainthermalstability,andeasilybecameinactivatedunderstrongalkalisandhightemperatureconditions.

AntinomyceteAM8;fermentationcondition;optimization;antibacterialactivesubstance

2017-01-03

张莉(1992-)，女，甘肃天水人，硕士研究生，研究方向：微生物与生化药学，E-mail：zldyxzl@126.com；通讯作者：倪孟祥，副教授，E-mail：nimx-2000@aliyun.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.06.011

TQ920.6

A

1672-5425(2017)06-0051-05

张莉，倪孟祥.海洋放线菌AM8发酵条件的优化及抑菌活性物质的初步研究[J].化学与生物工程，2017，34(6)：51-55.