核壳型色谱柱-高效液相色谱法快速分离检测水飞蓟素中7种非对映异构体

徐静涵，薛 芸，王 彦，闫 超

(上海交通大学，上海 200240)



核壳型色谱柱-高效液相色谱法快速分离检测水飞蓟素中7种非对映异构体

徐静涵，薛 芸，王 彦*，闫 超*

(上海交通大学，上海 200240)

采用核壳型色谱柱-高效液相色谱法快速分离检测水飞蓟素中7种非对映异构体，优化了液相色谱条件，实现了7种非对映异构体的快速完全分离，并应用于市售水飞蓟制剂的分离检测。优化色谱条件如下：核壳型Halo C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)、甲醇-水-甲酸(30∶70∶0.1)-甲醇为流动相、梯度洗脱、流速0.35 mL·min-1、进样量2 μL。该方法在0.01～0.1 mg·mL-1浓度范围内线性关系良好(R2>0.997)，色谱峰峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD)分别为1.74%和0.67%(n=6)。该方法操作简单、省时、分离度好，可用于水飞蓟制剂的分析检测，也为水飞蓟素中非对映异构体的分离检测提供新的思路。

高效液相色谱法；核壳型色谱柱；水飞蓟素；非对映异构体

水飞蓟[Silybum marianum(L.)Gaertn.]为菊科植物水飞蓟的干燥成熟果实，具有清热解毒、疏肝利胆的功效，常用于肝胆湿热、胁痛、黄疸等疾病的治疗[1]。水飞蓟的主要有效成分是以水飞蓟素(silymarin)为主的黄酮类化合物[2]，主要包括水飞蓟宾A/B(silybinA/B)、异水飞蓟宾A/B(isosilybinA/B)、水飞蓟亭A/B(silychristinA/B)、水飞蓟宁(silydianin)等7种非对映异构体化合物[3]，其结构式见图1。

图1 水飞蓟素中7种非对映异构体的结构式

水飞蓟宾A和水飞蓟宾B、异水飞蓟宾A和异水飞蓟宾B、水飞蓟亭A和水飞蓟亭B以及水飞蓟宾和异水飞蓟宾之间均互为差向异构体。水飞蓟宾是水飞蓟素的主要活性成分，具有抗氧化、抗纤维化、稳定细胞膜和调节肝再生能力等功能[4-5]；水飞蓟亭与水飞蓟宁的体外保肝作用均强于水飞蓟宾[6-7]，其抗氧化活性更高[8]，抗细胞光老化作用也更明显[9-10]。由于水飞蓟素中7种非对映异构体化合物的结构多样性以及生物活性的不同，对其的分离研究意义重大，但分离难度较大，难以实现完全分离。目前，主要的分析方法有：反相高效液相色谱法(RP-HPLC)[11-12]、超高效液相色谱法(UPLC)[13-14]、气相色谱法(GC)[15]、紫外分光光度法(UV)[16]、毛细管电泳法(CE)[17]等，其中RP-HPLC是应用最广的分析方法，但存在分析时间较长、分离度较低、难以完全分离等问题；UPLC虽然分离效率高，但成本高。核壳型色谱柱是一种新型色谱柱，由1.7 μm的实心核和0.5 μm的多孔壳组成，球形均匀，纵向扩散项小[18]，具有渗透性好、分离快速、系统反压较低、耐用性和稳定性出众等优点[19-20]。作者采用核壳型色谱柱-HPLC在较短时间内同时快速分离检测水飞蓟素，实现了7种非对映异构体的完全分离，为水飞蓟素及水飞蓟制剂的分离研究提供了一种高效、准确、便捷的方法。

1 实验

1.1 试剂与仪器

水飞蓟宾标准品(纯度≥98%，批号G25D5L1)、水飞蓟素标准品(纯度≥80%，批号R26N6L6634)，上海源叶生物科技有限公司；水飞蓟素胶囊(批号B1401476)，德国马博士大药厂；水飞蓟宾胶囊(批号550609056)，天津天士力圣特制药有限公司；水飞蓟宾葡甲胺片(批号151003446)，江苏中兴药业有限公司；保肝胶囊(批号3051012017)，美国Farlong公司；乙腈、甲醇，色谱纯，德国Merck公司；甲酸，分析纯，美国Aladdin公司；超纯水。

Shimadzu LC-20A型高效液相色谱仪，配有二元泵、进样器、柱温箱、紫外检测器、LC solution化学工作站，日本Shimadzu公司；LTQ XL型线性离子阱质谱仪，配有Xcalibur分析软件，美国Thermo Scientific公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；Milli-Q Integral型超纯水仪，重庆摩尔水处理设备有限公司；JD200-3型电子天平，郑州南北仪器设备有限公司；XW-800型涡旋混合器，上海青浦沪西仪器厂。

1.2 溶液的制备

水飞蓟宾、水飞蓟素标准品溶液的制备：精密称取标准品1.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成0.1 mg·mL-1的储备液，置于4 ℃冰箱储存，使用时用甲醇稀释。

水飞蓟宾胶囊、水飞蓟素胶囊、保肝胶囊供试品溶液的制备：精密称取胶囊内容物5.0 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声处理30 min，经0.22 μm滤膜过滤，备用。

水飞蓟宾葡甲胺片供试品溶液的制备：取片剂，去糖衣，研细；精密称取细粉5.0 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超声处理30 min，经0.22 μm滤膜过滤，备用。

1.3 实验条件

色谱条件：核壳型Halo C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)；流动相A为甲醇-水-甲酸(30∶70∶0.1)，流动相B为甲醇；梯度洗脱：0～30 min，20%～35% B；30～35 min，35% B；35～40 min，35%～20% B；流速0.35 mL·min-1；紫外检测波长288 nm；柱温25 ℃；进样量2 μL。

质谱条件：负离子扫描模式，毛细管电压-4 kV，毛细管温度350 ℃，扫描范围50～1 500 Da，鞘气流速35 arb，辅助气流速15 arb，碰撞诱导解离(CID)碰撞能量35%。

2 结果与讨论

2.1 水飞蓟素中7种非对映异构体的成分鉴定

通过对不同扫描模式的考察，发现水飞蓟素(m/z482)在负离子模式下能够获得更多的离子碎片信息，如图2所示。

图2 水飞蓟素的质谱图

水飞蓟素中7种非对映异构体均易失去一个质子形成 [M-H]-准分子离子峰，因此以m/z481作为母离子，分别对母离子进行碰撞诱导解离，获得二次碎裂产生的子离子(图3)。该方法可以获得化合物的一系列碎片信息，能够快速区分和鉴定同分异构体。

图3 水飞蓟素中7种非对映异构体的二级碎片质谱图

从图3可以看出，由于7种非对映异构体的结构不同，其二级质谱的子离子碎片也有非常显著的区别。水飞蓟亭A/B的二级质谱碎片中丰度最高的为m/z463、355，而水飞蓟宁的子离子碎片中则没有m/z355；对于差向异构体水飞蓟宾和异水飞蓟宾，水飞蓟宾A/B的二级质谱碎片中丰度最高的为m/z463、453、355、301，但异水飞蓟宾A/B的子离子碎片中没有m/z355，且m/z301的丰度也不高。结果与7种非对映异构体的子离子碎片裂解规律[13]相符。

根据主要的子离子碎片分别对水飞蓟素中7种非对映异构体进行成分鉴定，结果见表1。

表1 水飞蓟素中7种非对映异构体的二级质谱主要离子碎片的成分鉴定

2.2 HPLC条件考察

2.2.1 流动相中有机改性剂的选择

考察了不同流动相体系甲醇-水和乙腈-水对分离效果的影响，结果见图4。

由图4可知，乙腈为有机改性剂时，洗脱能力较强，整体保留时间缩短，但分离度下降，分离效果较差；甲醇为有机改性剂时，水飞蓟素中7种非对映异构体能够得到良好的分离。因此，选择甲醇作为流动相中的有机改性剂。

2.2.2 进样量的选择

考察了进样量(20 μL、10 μL、5 μL、2 μL)对分离效果的影响，结果见图5。

1～7：水飞蓟亭A/B、水飞蓟宁、水飞蓟宾A/B、异水飞蓟宾A/B

1～7：水飞蓟亭A/B、水飞蓟宁、水飞蓟宾A/B、异水飞蓟宾A/B

由图5可知，随着进样量的减少，色谱峰的峰型及分离度都有了显著改善，与样品浓度无明显关系。因此，为保证分离效果及准确性，选择进样量为2 μL。

2.2.3 色谱柱的选择

考察了普通C18色谱柱与核壳型Halo C18色谱柱对分离效果的影响，结果见图6。

由图6可知，使用普通C18色谱柱时，尽管增长柱长及调节流动相流速，但水飞蓟素中7种非对映异构体仍然存在色谱峰分离度较低、分离效果不佳、分离时间长等问题；使用核壳型Halo C18色谱柱时，分离时间较普通C18色谱柱缩短了35.5%，分离效果良好。因此，选择2.7 μm Halo C18色谱柱。

2.2.4 色谱柱柱长的选择

考察了Halo C18色谱柱柱长(100 mm、150 mm)对分离效果的影响，结果见图7。

1～7：水飞蓟亭A/B、水飞蓟宁、水飞蓟宾A/B、异水飞蓟宾A/B

a.100 mm b.150 mm

由图7可知，随着色谱柱柱长的改变，水飞蓟素中7种非对映异构体的保留时间基本不变；但当使用150 mm柱长色谱柱时，水飞蓟亭B与水飞蓟宁的分离度显著提高，是使用100 mm柱长色谱柱时分离度的3倍。因此，选择150 mm柱长的Halo C18色谱柱。

2.2.5 最优分离条件下的色谱图

综上，确定最优分离条件为：Halo C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)；流动相A为甲醇-水-甲酸(30∶70∶0.1)，流动相B为甲醇；梯度洗脱；流速0.35 mL·min-1；进样量2 μL。在此最优条件下，水飞蓟素中7种非对映异构体的色谱图见图8。

由图8可知，在最优分离条件下，水飞蓟素中7种非对映异构体被快速完全分离。

1～7：水飞蓟亭A/B、水飞蓟宁、水飞蓟宾A/B、异水飞蓟宾A/B

2.3 分析方法的评价

2.3.1 线性实验

取水飞蓟宾标准品溶液，用甲醇分别稀释至0.01 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.07 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1，分别进样，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，得到水飞蓟宾的线性回归方程为：y=28089x+116.72，R2=0.997。表明，水飞蓟宾在0.01～0.1 mg·mL-1浓度范围内线性关系良好，检出限为20.0 ng·mL-1。

2.3.2 精密度实验

在确定的最优色谱条件下，将水飞蓟素标准品溶液重复进样6次，计算水飞蓟宾的色谱峰峰面积及保留时间的相对标准偏差(RSD)分别为1.74%和0.67%。表明，本方法具有良好的精密度及重现性。

2.4 水飞蓟制剂样品分析

采用核壳型色谱柱-高效液相色谱法在最优色谱条件下，对市售水飞蓟制剂中常见的水飞蓟宾胶囊、水飞蓟宾葡甲胺片、水飞蓟素胶囊、保肝胶囊分别进行分离检测，结果见图9。

由图9可知，该方法能够很好地将水飞蓟制剂中的水飞蓟宾及水飞蓟素中7种非对映异构体分离，可用于实际制剂中水飞蓟宾及水飞蓟素的定性定量检测。

采用核壳型色谱柱-高效液相色谱法检测4种水飞蓟制剂，结果发现，在水飞蓟宾胶囊、水飞蓟宾葡甲胺片中均检测到水飞蓟宾，含量分别为95.7%和96.9%；在水飞蓟素胶囊、保肝胶囊中均检测到水飞蓟素中的7种非对映异构体，含量以水飞蓟宾计分别为50.2%和11.1%，浓度均在线性范围内。表明，4种水飞蓟制剂均符合成分要求，其中水飞蓟宾胶囊与水飞蓟宾葡甲胺片中水飞蓟宾含量较高可能是因为药物为化学合成[21-22]，具有较高的纯度；水飞蓟素胶囊与保肝胶囊中水飞蓟宾含量较低可能是因为药物是从天然植物中提取，可能含有其它成分。

a.水飞蓟宾标准品 b.水飞蓟宾胶囊 c.水飞蓟宾葡甲胺片 d.水飞蓟素标准品 e.水飞蓟素胶囊 f.保肝胶囊

3 结论

建立了核壳型色谱柱-高效液相色谱法快速分离检测水飞蓟素中水飞蓟亭A/B、水飞蓟宾A/B、异水飞蓟宾A/B、水飞蓟宁等7种非对映异构体的分离分析方法，解决了非对映异构体及差向异构体之间难以分离、分析时间长的问题，实现了7种非对映异构体的完全分离。通过对分析条件的优化，充分发挥了核壳型色谱柱的优势，明显缩短了分离时间，取得了良好的峰型和分离度，并应用于4种市售水飞蓟制剂样品的定性定量检测。该方法具有快速高效的优势，且操作简单、结果可靠。未来针对水飞蓟素中的单个或多个异构单体的研究可以利用该方法开展实验，配合适宜的前处理方法，也可对血样、尿样等代谢产物进行检测，为中药有效成分的分析检测提供了一种快速且行之有效的方法，也为非对映异构体的分离检测提供了新的思路。

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Rapid Separation and Determination of Seven Diastereoisomers in Silymarin by Core-Shell Column-High Performance Liquid Chromatography

XU Jing-han,XUE Yun,WANG Yan*,YAN Chao*

(ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,China)

Inthisstudy,sevendiastereoisomersinsilymarinwereseparatedanddeterminedrapidlybycore-shellcolumn-highperformanceliquidchromatography(HPLC).Thechromatographicconditionswereoptimized,rapidseparationofsevendiastereoisomerswereachieved,andtheseparationanddeterminationofthecommoncommercialSilybum marianumpreparationswerealsocarriedoutwiththismethod.Theoptimumchromatographicconditionswereasfollows:HaloC18column(150mm×4.6mm,2.7μm),gradientelutionwithmethanol-water-formicacid(30∶70∶0.1)-methanolasamobilephase,flowrateof0.35mL·min-1,injectionvolumeof2μL.Thelinearrelationshipwasgoodintherangeof0.01～0.1mg·mL-1(R2>0.997).Therelativestandarddeviation(RSD)ofthechromatographicpeakareaandtheretentiontimewere1.74%and0.67%(n=6),respectively.Theadvantagesofthismethodaresimpleoperation,shorttimeandhighseparationdegree.ItcanbeusedtoanalyzeSilybum marianumpreparations,andalsoprovidesanewideafortheseparationanddeterminationofdiastereoisomersinsilymarin.

highperformanceliquidchromatography(HPLC);core-shellcolumn;silymarin;diastereoisomer

上海市科委科研计划项目(15142200200，16142200300)，上海市博士后基金项目(14R21422700)，上海市引进技术的吸收与创新专项(XC-ZXSJ-02-2016-11)

2017-02-14

徐静涵(1991-)，女，福建福州人，硕士研究生，研究方向：药物分析，E-mail：xujinghan118@163.com；通讯作者：王彦，副教授，E-mail：wangyan11@sjtu.edu.cn；闫超，教授，E-mail：chaoyan@sjtu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.06.014

O658 O657.72

A

1672-5425(2017)06-0065-06

徐静涵，薛芸，王彦，等.核壳型色谱柱-高效液相色谱法快速分离检测水飞蓟素中7种非对映异构体[J].化学与生物工程，2017，34(6)：65-70.