利用木瓜蛋白酶和α-淀粉酶澄清红茶茶汤的研究

钟艳梅，曾宪录，郑清梅，何曼怡

（嘉应学院生命科学学院，广东梅州514015）

利用木瓜蛋白酶和α-淀粉酶澄清红茶茶汤的研究

钟艳梅，曾宪录，郑清梅，何曼怡

（嘉应学院生命科学学院，广东梅州514015）

为得到优质红茶饮料，利用外源木瓜蛋白酶和α-淀粉酶对红茶茶汤进行沉淀澄清研究。结果表明：两种酶均能显著提高茶汤透光率，起到澄清作用，且效果相当。木瓜蛋白酶最佳反应条件为酶添加量0.3 U/mL、作用温度50℃、作用时间45 min、pH6；α-淀粉酶最佳反应条件为酶添加量30 U/mL、作用温度45℃、作用时间15 min、pH5，但在各自最佳条件下两种酶未表现出协同作用。

木瓜蛋白酶；α-淀粉酶；红茶；澄清

在我国茶饮料生产中，茶汤沉淀问题成为制约其市场迅速发展的主要因素[1]。现代茶学研究理论认为，茶饮料沉淀形成主要是蛋白质、茶多酚、咖啡碱等分子间氢键与疏水作用，茶汤温度较高时，这些物质各自呈游离状态存在，但当温度降低，茶黄素、茶红素及其没食子酸酯等多酚类物质的酚羟基，可分别与蛋白质的肽键、咖啡碱以氢键结合形成络合物，从而产生茶汤沉淀即“冷后浑”现象[2]。

沉淀形成不仅会影响茶饮料的风味和外观品质，也会导致大量有效成分损失。酶法转溶茶汤沉淀是近几年来茶饮料加工技术的研究热点之一[3-6]，目前应用较多的酶有单宁酶（Tannase）、果胶酶（Pectase）、木瓜蛋白酶（Papain）等，宁井铭[7]的研究结果表明，单宁酶、果胶酶、木瓜蛋白酶对绿茶茶汤抗沉淀影响达极显著性水平，经木瓜蛋白酶处理的茶汤蛋白质含量减少，氨基酸含量有一定的增加；黄彤[8]也证实了上述3种酶能减少绿茶茶汤沉淀产生，此外还发现单宁酶和葡萄糖氧化酶具有复合作用，不仅能有效延缓绿茶茶汤贮存过程色度升高，还能显著减少茶汤沉淀产生；Coopper[9]的研究也表明，经木瓜蛋白酶处理的茶汤在0℃～2℃下过滤后，即使加入柠檬酸等物质，在低温下长时间储存也不会产生沉淀。另外，α-淀粉酶（α-Amylase）能够分解茶汤中的淀粉物质，提高茶汤的澄清度[10]。综合目前国内外液态茶饮料酶澄清技术来看，主要以单宁酶为主，但利用木瓜蛋白酶和α-淀粉酶来澄清红茶茶汤的研究目前还鲜见报道，本研究可为红茶饮料加工提供技术上的支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料：梅州清凉山红茶加工过程中的茶叶碎（含部分茶梗）。

T6可见分光光度计：上海沪粤明科学仪器有限公司；FB224电子分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HH.SY11-N14数显恒温水浴锅：常州华冠仪器厂；L420台式低速离心机：济南博华仪器设备有限公司；木瓜蛋白酶（Papain，100 000 U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；α-淀粉酶（α-Amylase，20 000 U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司。

1.2 红茶茶汤制备

将红茶粉碎过40目筛，茶水比1∶20（g/mL），超声波辅助浸提20 min～30 min，浸提温度60℃，冷却后以3 500 r/min离心15 min得到红茶茶汤。

1.3 单酶源澄清红茶茶汤的研究

1.3.1 单因素试验

1.3.1.1 酶不同添加量

分别取100 mL红茶茶汤，调节pH值为6.0，木瓜蛋白酶分别按0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 U/mL的量添加，60℃水浴30 min；α-淀粉酶则分别按10、20、30、40、50、60 U/mL的量添加，60℃水浴10 min，以透光率为指标分别筛选最佳酶添加量。

1.3.1.2 酶不同反应温度

木瓜蛋白酶添加量为0.2 U/mL，设置不同水浴温度分别为45、50、55、60、65、70℃；α-淀粉酶添加量为20 U/mL，设置不同温度为35、40、45、50、55、60℃，其它条件和处理同1.3.1.1，以透光率分别筛选最佳反应温度。

1.3.1.3 酶不同反应时间

木瓜蛋白酶添加量0.2 U/mL，水浴温度60℃，设置不同反应时间分别为15、30、45、60、75、90 min；α-淀粉酶添加量20 U/mL，水浴温度60℃，分别反应5、10、15、20、25、30 min，其它条件和处理同1.3.1.2，以透光率分别筛选最佳酶反应时间。

1.3.1.4 不同反应pH值

木瓜蛋白酶添加量0.2 U/mL，设置不同反应pH分别为3、4、5、6、7、8，60℃水浴30 min；α-淀粉酶添加量20 U/mL，pH设置与木瓜蛋白酶同，60℃水浴10 min，以透光率分别筛选最佳酶反应pH值。

1.3.2 正交优化试验

在单因素试验基础上，分别对两种酶的添加量、水浴温度、反应时间、pH值主要影响因子进行四因素三水平的正交试验，正交因素水平设计如表1。

1.4 木瓜蛋白酶与α-淀粉酶协同作用澄清红茶茶汤的研究

先木瓜蛋白酶后α-淀粉酶（处理1）、先α-淀粉酶后木瓜蛋白酶（处理2）：两种酶澄清红茶茶汤时均采用正交优化后的最佳试验条件，以无加酶和只加木瓜蛋白酶或α-淀粉酶作对照。

表1 单酶源澄清茶汤的正交试验设计Table 1 Orthogonal experimental design of clarification of tea soup by single enzyme

1.5 透光率测定

将酶澄清处理后的红茶汤沸水浴30 s终止反应，以3 500 r/min转速离心15 min后用锡箔纸密封，置于4℃下冷藏过夜，次日取出，待样品恢复室温后，以蒸馏水为参比，在660 nm波长下测其透光率。T=10-A（式中：T为透光率；A为吸光度）。

1.6 数据处理

所有数据采用Excel 2003和Originpro 8.5软件进行分析，采用Duncan法（P<0.05）进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 单酶源澄清红茶茶汤结果

2.1.1 酶不同添加量对茶汤透光率的影响

酶不同添加量对茶汤透光率的影响结果如图1、图2所示。

图1 木瓜蛋白酶不同添加量的茶汤透光率Fig.1 The tea soup transmittance of different amount of papain

由图1、图2可知，两种酶都有一个共同特点：即在一定浓度范围内，茶汤透光率随着酶添加量增加而升高，说明两种酶对红茶茶汤均有澄清作用，但浓度再增加时透光率变化趋势平缓甚至略有下降，原因可能是酶固体制剂过多添加，导致酶残留在茶汤中所致。由图可知，木瓜蛋白酶最适添加量为0.4 U/mL，α-淀粉酶最适添加量为40 U/mL。

图2 α-淀粉酶不同添加量的茶汤透光率Fig.2 The tea soup transmittance of different amount of αamylase

2.1.2 酶不同反应温度对茶汤透光率的影响

酶不同反应温度对茶汤透光率的影响如图3、图4所示。

图3 木瓜蛋白酶不同反应温度的茶汤透光率Fig.3 The tea soup transmittance of different temperatures of papain

图4 α-淀粉酶不同反应温度的茶汤透光率Fig.4 The tea soup transmittance of different temperatures of αamylase

由图3、图4可知，木瓜蛋白酶澄清茶汤时，在45℃～55℃范围内，随着温度升高茶汤透光率迅速升高，在55℃时最高，但高于55℃时，透光率下降；而α-淀粉酶澄清茶汤时也有类似情况出现，在35℃～50℃范围内，随着温度升高茶汤透光率升高，在50℃时最高，但温度进一步升高时，透光率迅速下降。原因可能是升温加快酶失活的效应占主导地位，特别是α-淀粉酶对温度尤其敏感。因此，木瓜蛋白酶的最适温度选择55℃，α-淀粉酶最适温度选择50℃。

2.1.3 酶不同反应时间对茶汤透光率的影响

酶不同反应时间对茶汤透光率的影响如图5、图6所示。

图5 木瓜蛋白酶不同反应时间的茶汤透光率Fig.5 The tea soup transmittance of different times of papain

图6 α-淀粉酶不同反应时间的茶汤透光率Fig.6 The tea soup transmittance of different times of α-amylase

由图5、图6可知，木瓜蛋白酶作用时间在15 min～60 min范围内，茶汤透光率随时间延长而增加，当反应时间增加到75 min时，茶汤透光率有所下降，再延长到90 min时又升高，可能是时间长产生静置沉淀作用，故选取60 min为木瓜蛋白酶最适反应时间。α-淀粉酶也出现类似现象，故选取20 min为其最适反应时间。

2.1.4 不同反应pH值对茶汤透光率的影响

pH值不但会影响酶的反应速度，还对茶汤透光率有影响，酶不同反应pH值对茶汤透光率的影响如图7、图8所示。

图7 木瓜蛋白酶不同反应pH值的茶汤透光率Fig.7 The tea soup transmittance of different pH of papain

图8 α-淀粉酶不同反应pH值的茶汤透光率Fig.8 The tea soup transmittance of different pH of α-amylase

由图7、图8可知两种酶共同特点为：反应pH值在3～5范围内，茶汤透光率随pH值升高而显著增加，pH值为5时，两者透光率达到最大值；以后随着pH值增加，茶汤的透光率急剧下降。故两种酶澄清茶汤的最适pH值均选择5。

2.1.5 单酶澄清茶汤沉淀工艺条件的正交优化

木瓜蛋白酶与α-淀粉酶正交试验结果及方差分析见表2和表3。

表2 木瓜蛋白酶与α-淀粉酶正交试验结果Table 2 The results of orthogonal experiment of papain and αamylase

续表2 木瓜蛋白酶与α-淀粉酶正交试验结果Continue table 2 The results of orthogonal experiment of papain and α-amylase

表3 木瓜蛋白酶与α-淀粉酶正交试验的方差分析Table 3 The variance analysis of the orthogonal experiment of papain and α-amylase

木瓜蛋白酶澄清茶汤时，据表2极差分析结果，各因素对茶汤透光率影响的大小顺序为D＞B＞A＞C，即pH值影响最大，温度次之，酶添加量和反应时间对试验结果影响最小。优组合为A1B1C3D3，但据表3方差分析结果可知D因素（pH值）对茶汤透光率影响显著，其它因素则不显著。从节约时间和能源角度出发，工艺条件经正交优化后，以A1B1C1D3组合为优，即酶添加量0.3 U/mL，反应温度50℃，反应时间45 min，pH 6。

α-淀粉酶澄清茶汤时，从表2可知各因素对茶汤透光率影响的大小顺序为D＞A＞B＞C，说明pH值是影响茶汤透光率的主要因素。优组合为A3B3C3D2，从表3方差分析结果可知D因素（pH值）对茶汤透光率影响显著，其它因素也不显著。从节约能源和时间角度出发，优化后的最佳工艺条件组合为A1B1C1D2，即酶添加量30 U/mL，反应温度45℃，反应时间15 min，pH 5。

对两种酶的最佳反应条件进行了验证试验，结果表明：木瓜蛋白酶澄清茶汤的透光率达到63.3%，而α-淀粉酶的也达到62.0%，具有良好的澄清效果。

2.2 木瓜蛋白酶与α-淀粉酶协同作用澄清茶汤结果

木瓜蛋白酶与α-淀粉酶协同澄清茶汤结果见表4。

表4 木瓜蛋白酶与α-淀粉酶协同澄清茶汤结果Table 4 The results of synergy clarification of tea soup by papain and α-amylase

两种酶的最佳反应温度、时间、pH值不一样，故不能同时添加，只能先后添加，否则会影响酶制剂的作用效果。由表4可知，在各自最优条件下，与无加酶组对比，单独添加时，无论是木瓜蛋白酶还是α-淀粉酶，都能显著提高茶汤透光率，起到澄清作用，且两种酶效果相当。但两种酶协同作用时，对茶汤的澄清效果并不明显，反而比各自单独添加时的透光率要降低，这一现象说明：红茶茶汤中沉淀物质的量是一定的，过多添加外源酶对沉淀物的去除未必有益，反而因酶残留造成澄清度下降。

3 结论与讨论

本研究以红茶加工中产生的碎茶为原料，对其茶汤通过添加外源木瓜蛋白酶和α-淀粉酶进行澄清处理，结果表明添加这两种酶制剂均能提高茶汤透光率，起到澄清茶汤作用，得到木瓜蛋白酶最佳添加量为0.3 U/mL、反应温度50℃，反应时间45 min，pH 6；α-淀粉酶最佳添加量为30 U/mL，反应温度45℃，反应时间15 min，pH 5，为红茶废物利用和茶饮料加工提供技术支持和理论依据。

木瓜蛋白酶可促进茶汤蛋白质分解，减少蛋白质-茶多酚复合物形成[4]，故在红茶饮料加工中可使茶汤澄清。α-淀粉酶能将茶汤中淀粉物质切断成长短不一的短链糊精和少量的低分子糖类，从而使淀粉糊的黏度迅速下降，起到降低稠度和“液化”的作用，从而提高茶汤澄清度。将这两种酶应用于红茶茶汤澄清，不会把有益成分去除，只是转变了物质的存在形式而已，故具有一定的应用价值和发展前景。

木瓜蛋白酶和α-淀粉酶的协同作用没有出现预期效果，可能因添加的酶量过多，影响了茶汤透光率，可通过调整两者的添加量及比例，探讨协同效应，从而使研究结果更有参考价值。此外还应通过感官评价两种酶的添加导致蛋白质和淀粉的减少，是否会影响茶汤的色泽、口感等。

单宁酶是目前用于茶汤澄清的主要酶制剂，但价格高、成本大，木瓜蛋白酶和α-淀粉酶的价格相对较低，而且具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此不失为茶饮料加工中澄清剂的一种好选择。此外我们还可以研究这3种酶的共同作用，制作高效且性能稳定的复合酶制剂。

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Research on the Clarification of Black Tea Soup with Papain and α-Amylase

ZHONG Yan-mei，ZENG Xian-lu，ZHENG Qing-mei，HE Man-yi
（School of Life Sciences，Jiaying University，Meizhou 514015，Guangdong，China）

The clarification effect of exogenous papain and α-amylase on black tea soup were investigated.Results indicated that both two enzymes were able to significantly increase the transmittance rate，and the two enzymes demonstrated no significant difference for clarification of tea.The optimal reaction conditions for papain were：addition amount of enzyme to be 0.3 U/mL，treatment temperature to be at 50℃，treatment time 45 min at pH 6；and the optimal conditions for α-amylase were：enzyme amount to be 30 U/mL，treatment temperature to be at 45℃，treatment time to be 15 min at pH 5.

papain；α-amylase；black tea；clarification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.018

2016-09-23

广东省教育厅自然科学基金（Yq2013152）

钟艳梅（1975—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：食品资源研究开发。