鸭绿江流域北冰红冰葡萄酒天然酵母菌性能研究

牛国焕，宋文军，郝亚波，王廷刚

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134）

鸭绿江流域北冰红冰葡萄酒天然酵母菌性能研究

牛国焕，宋文军*，郝亚波，王廷刚

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津300134）

从鸭绿江流域的北冰红葡萄果皮及其生长土壤中筛选适合酿造北冰红冰葡萄酒的耐低温、耐高糖酵母菌，并对其基本形态特征、生理特性及发酵特性进行了研究。结果表明：B④的耐糖性优于商业酵母LB，其在糖度500 g/L、pH3.0～4.0、温度10℃～12℃时生长良好，受酒精、SO2影响相对较小。在糖度360g/L的冰葡萄汁中发酵结束后，酒精度为13.5%vol，残糖量为130g/L，感官品评协调，酒体饱满浓郁，果香突出，适合冰酒生产。

耐低温；耐高糖；酿酒酵母；发酵

冰酒之所以被称为“液体黄金”[1]，是因为酿造冰酒不仅对获得原料的气候条件要求非常严苛[2]，而且冰酒原料的高糖、高酸环境以及低温发酵都对酵母提出了更苛刻的要求。ST、N96、EC1118是目前被加拿大科学家Erasmus等鉴别出的适合酿造雷司令冰酒的商业酵母[3]。WY1、WY3、WY4是裴广仁等筛选出的适合辽宁桓仁冰酒产区威代尔冰酒酿造的商业酵母[4]。南海龙等研究北冰红山葡萄进行冰酒酿造工艺研究时也选用了商业酵母（F33∶VL1∶ST=1∶1∶1）[5]。由此看出，我国酿造冰酒的酵母大多依赖进口，缺乏适合我国葡萄品种的本土酵母，很难表现出我国冰酒的风味。因此，我国的冰酒产业发展受到了一定程度的限制[6]。

本实验所用葡萄品种为“北冰红”[7]，生长在有“塞外江南”美誉的鸭绿江流域，它是目前国内外培育出的第一个酿造冰葡萄酒的山葡萄品种[8]。其果实含糖量高，总酸和单宁适中，克服了以往山葡萄品种糖度低、酸度高的缺点，为酿造优质的冰葡萄酒提供了原料基础。通过从北冰红葡萄的果皮及其生长土壤中筛选出耐低温、耐高糖的冰葡萄酒酿酒酵母，并对其进行生理生化、遗传及发酵性能的研究，进一步为生产本土特色的冰葡萄酒提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

采自鸭绿江流域的北冰红葡萄及其生长土壤。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌种的初步鉴定

进行酵母菌的形态观察[9]、生理生化试验[10-11]及酵母菌的18S rDNA基因测序[12-14]。

1.2.2 菌株的性能研究

采用不同葡萄糖浓度（300、400、500、600、700 g/L）、温度（8、10、12、14℃）、酒精浓度（3%、5%、7%、9%、11%，13%、15%）、SO2浓度（60、100、150、200、250、300、400、500 mg/L）、pH（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0）的50 mL的液体培养基，按5%的接种量接种，16℃恒温培养48 h，选用660 nm波长进行培养液OD值的测定。

1.2.3 葡萄汁发酵实验

将活化的菌株按10%的接种量接种到200 mL的葡萄汁中，调整SO2浓度为80 mg/L，于12℃条件下进行发酵，酒精发酵结束后，测定发酵液的残糖含量及酒精度（发酵力采用CO2失重法；酒精采用酒精计法；残糖采用直接滴定法）并按照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行感官品尝。

2 结果与分析

2.1 酵母菌种的初步鉴定

将挑选出的三株菌株及商业酵母LB在麦芽汁培养基中进行涂布培养48h后，其形态如图1、图2所示[15-16]。

图1 酵母菌菌落形态Fig.1 Yeast colony morphology

图2 酵母菌显微镜形态Fig.2 Yeast microscopy morphology

通过YPD培养基培养后观察，培养基表面均无菌醭生成，但三角瓶壁上面有菌环生成，且均有白色沉淀生成，质地紧密。表1所示，筛选出的菌株形态为圆形或近圆形，出芽繁殖，且不产生假菌丝，符合酿酒酵母的基本形态特征。

表1 酵母菌的形态特征鉴定结果Table 1 The test result of the morphological characteristics of yeasts

2.2 酵母菌种的生理、生化鉴定

根据J.A巴尼特《酵母菌的特征与鉴定手册》对G①、H②、B④及LB菌株进行生理生化试验，包括糖类发酵试验、碳源同化试验、氮源同化试验。结果见表2。

2.3 酵母菌种的分子生物学鉴定

以菌株G①、H②、B④的总DNA为模板，ITS1/ ITS4为引物进行基因扩增，以18S rDNA基因序列进行测序，结合《酵母菌的特征与鉴定手册》，G①、H②、B④均被鉴定为酵母菌。

2.4 菌株的性能分析

酿造冰酒要求葡萄汁含糖量为320 g/L～360 g/L，在高糖情况下，容易导致细胞破裂，因此要求菌株能够耐渗透压。各菌株的耐高糖性结果见图3。

由图3可知，各菌株在葡萄糖为300 g/L～400 g/L时生长良好。当糖度增加至500 g/L后，各菌株生长受到抑制。在此浓度下，B④菌株的耐高糖性比LB高13%。

表2 酵母菌生理、生化试验结果Table 2 The test result of the physiological and biochemical yeasts

图3 各菌株在不同葡萄糖浓度下的OD值Fig.3 The OD value of each strain at different glucose concentrations

温度是影响菌株生长发酵的重要因素。若培养温度过高，酵母出芽率会降低；若温度过低，则会导致发酵速度减慢甚至发酵终止。因此发酵温度控制在10℃～12℃，菌株需要有较好的耐低温能力。各菌株的耐低温性结果见图4。

图4 各菌株在不同温度下的OD值Fig.4 The OD of each strain at different temperatures

由图4可知，在8℃时各菌生长缓慢，在10℃～12℃时，H②生长速度最快。与LB相比，各菌株在10℃～12℃时均长势良好，适合冰酒的发酵。

酵母菌在无氧的条件下产乙醇和二氧化碳，但酒精达到一定浓度时也会抑制酵母的生长代谢。因此需要菌株有较好的耐酒精的能力。各菌株的耐酒精性结果见图5。

图5 各菌株在不同乙醇浓度下的OD值Fig.5 The OD value of each strain at different ethanol concentrations

由图5可知，所有菌株随着乙醇浓度的升高生长受到抑制。乙醇浓度大于7%时，G①、H②急剧下降，说明菌株的生长开始受酒精的影响增大。与LB相比，B④菌株受酒精影响相对较小。

SO2在葡萄酒生产过程中有抑菌、增色、增酸和改善口感质量等作用，我国规定葡萄酒中SO2添加量不能超过300 mg/L，因此菌株需要有较高的耐SO2能力。各菌株的耐SO2性结果见图6。

由图6可知，当添加量浓度小于250 mg/L，三支菌均表现出较好的耐性，当添加量大于400 mg/L，菌株的生长受到抑制。与LB相比，B④菌株受SO2影响相对较小。

pH值是葡萄酒生产的重要条件，pH值越高，紫红色逐渐消失变成蓝色色调，色泽和透明度变差，所以要选择能够在pH3.0～3.6条件下生长较好并且代谢旺盛的菌株。各菌株的耐pH性结果见图7。

如图7可知，与LB相比，各菌株均在pH3.0～4.0时生长良好。

图6 各菌株在不同SO2浓度下的OD值Fig.6 The OD value of each strain at different SO2concentrations

图7 各菌株在不同pH下的OD值Fig.7 The OD value of each strain at different pH

2.5 葡萄汁发酵试验

根据菌株发酵性能实验结果，选择H②、B④及LB进行葡萄汁发酵试验。各菌株的发酵试验结果见表3、表4。

表3 酵母菌发酵试验CO2失重Table 3 Weight lose of fermentation test

表4 酵母菌发酵液酒精度与残糖Table 4 Yeast fermentation liquor alcohol content and the residual sugar

表3所示，各菌株发酵启动时间相似，并均在2 d达到高峰。与商用酵母LB相比，菌株B④启动速度快，但发酵周期较长。由表4可以看出，各菌均能完成酒精发酵。由表3、表4可知，B④性能稳定，发酵力强，产酒精量高，与商业菌对照结果相近。

3 结论

从鸭绿江流域的北冰红葡萄果皮及生长土壤中筛选适合酿造北冰红冰葡萄酒的耐低温、耐高糖的菌株，其菌落表面光滑，边缘整齐，乳白色，突起，细胞多为较大圆形或卵圆形。经18SrDNA基因序列测序，结合《酵母菌的特征与鉴定手册》，G①、H②、B④均被鉴定为酵母菌。结果表明，B④的耐糖性优于商业酵母LB 13%，其在糖度500 g/L、pH3.0～4.0、温度10℃～12℃时生长良好，受酒精、SO2影响相对较小。在糖度360 g/L的冰葡萄汁中发酵结束后，酒精度为13.5%vol，残糖量为130 g/L，感官品评协调，符合冰酒生产的工艺要求。

[1]黄卫东,李景明,王秀芹.冰葡萄酒生产及其在我国的发展[J].农产品加工(学刊),2005,45(Z2)：56-61

[2]公维庶.牡丹江地区冰葡萄生产和冰葡萄酒酿造[J].中国林副特产,2013(4)：46-47

[3]Erasmus D J,Cliff M,Hjjvan V.Impact of yeast strain on the production of acetic acid,glycerol,and the sensory attributes of icewine.[J].American Journal of Enology&Viticulture,2004,55 (12)：883-883

[4]裴广仁,李记明,赵玉平,等.冰葡萄酿酒酵母的筛选[J].食品与发酵工业,2010,36(6)：98-102

[5]南海龙,周岩,杨玉平,等.北冰红山葡萄冰葡萄酒酿造工艺的研究[J].酿酒科技,2014(5)：36-38

[6]祖显生,刘树文,何玲,等.高产多糖干白葡萄酒酵母的初步筛选及其发酵特性研究[J].酿酒科技,2007(12)：36-39

[7]杨明挚,杨华峰,罗金海,等.云南高原冰葡萄酒生产可行性理论与实践[J].酿酒科技,2007(5)：42-44

[8]宋润刚,路文鹏,沈育杰,等.酿酒葡萄新品种‘北冰红’[J].园艺学报,2008,35(7)：1085

[9]沈萍,陈向东.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社,2007：73-74

[10]周德庆.微生物学教程[M].北京：高等教育出版社,2011：47-52

[11]巴尼特 J A.酵母菌的特征与鉴定手册[M].青岛：海洋大学出版社,1991：20-26

[12]王萍,厉荣玉,董群.白假丝酵母菌DNA提取方法的研究[J].热带医学杂志,2008,8(12)：1222-1224

[13]Ros-Chumillas M,Egea-Cortines M,Lopez-Gomez A,et al.Evaluation of a rapid DNA extraction method to detect yeast cells by PCR in orange juice[J].Food Control,2007,18(1)：33-39

[14]Vasdinyei R,Deák T.Characterization of yeast isolates originating from Hungarian dairy products using traditional and molecular identification techniques.[J].International Journal of Food Microbiology, 2003,86(1/2)：123-130

[15]彭欣莉.山葡萄酵母的筛选及初步鉴定[J].吉林工程技术师范学院学报,2012,28(12)：72-74

[16]左勇,杨小龙,傅彬,等.野生猕猴桃果酒酵母菌的筛选及鉴定[J].酿酒科技,2015(11)：37-40

Study on the Performance of Natural Yeast in the Ice Wine Beibinghong of the Yalu River Basin

NIU Guo-huan，SONG Wen-jun*，HAO Ya-bo，WANG Ting-gang
（Institute of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

The yeasts，previously selected for their ability to bear the low temperature and high sugar form the Beibinghong grape peel and soil of the Yalu River basin，were analyzed the trait of the basic morphological characteristics，physiological characteristics and fermentation characteristics.The results manifested that the sugar tolerance of B④was better than LB，and B④ performs best at 10℃-12℃，in the conditions of 500 g/L sugar and pH 3.0-4.0，and the affection is relatively smaller by the alcohol and SO2.The data of alcohol and residual sugar was 13.5%vol and 130 g/L when the fermentation was stopped，which conducted in the grape must（360 g/L sugar）.The sensory coordination，full-bodied flavor and aroma are the evaluations of the wine by the wine experts.B④were identified as the most suitable yeast strains for the production of ice wine.

low temperature tolerance；high glucose tolerance；S.cerevisiae；fermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.035

2017-03-16

天津商业大学横向课题项目（G16014）

牛国焕（1981—），女（汉），工程师，硕士研究生，研究方向：发酵工程。

*通信作者：宋文军（1967—），男，副教授，博士，从事生物技术与食品科学研究。