高效液相色谱法测定彩色马铃薯中维生素C含量

王辉，刘辉，刘嘉，吕都，李俊，陈朝军，董楠，唐健波，陈中爱，刘永翔

（贵州省农业科学院贵州省生物技术研究所，贵州贵阳550006）

高效液相色谱法测定彩色马铃薯中维生素C含量

王辉，刘辉，刘嘉，吕都，李俊，陈朝军，董楠，唐健波，陈中爱，刘永翔*

（贵州省农业科学院贵州省生物技术研究所，贵州贵阳550006）

建立高效液相色谱法快速测定彩色马铃薯黑美人、红宝石中维生素C含量的方法。样品采用2%草酸提取，利用高效液相色谱技术，以0.05 mol/L，pH2.5的磷酸-甲醇（90∶10）缓冲液为流动相，通过C18色谱柱分离，采用紫外检测器，在245nm波长下测定维生素C的吸光值，将吸光值与标准品进行比较，保留时间可以对其进行定性，以峰面积进行定量。结果表明，方法的线性范围0.02 g/L～0.1 g/L，检出限为0.002 g/L，线性回归方程为yb=5 622 000x+69 538，相关系数为0.999 9。通过回收实验，黑美人与红宝石马铃薯VC测定回收率分别为97.61%～99.81%，97.28%～99.82%，相对标准偏差分别为0.90%、1.02%。用高效液相色谱法、紫外分光光度法、碘滴定法分别测定黑美人中VC含量分别为（21.27±0.19）、（19.92±0.13）、（23.31±0.11）mg/100 g，红宝石中VC含量分别为（18.28±0.19）、（17.68±0.14）、（21.76±0.09）mg/100 g。与甘肃省农业科学院农业测试中心检测结果相比较（黑美人21.73 mg/100 g；红宝石18.74 mg/ 100 g），表明高效液相色谱法获得结果更准确可靠。本研究所建立的高效液相色谱法可快速、灵敏、准确、稳定的对彩色马铃薯中的维生素C进行测定，同时适用于其它同类果蔬（草莓、刺梨、青菜等）中VC含量的测定。

高效液相色谱；黑美人土豆；红宝石土豆；维生素C

通常所说的彩色马铃薯一般是指块茎的皮或肉为红、蓝、紫、橙色等的马铃薯品种[1]。“黑美人”马铃薯是一种表皮与果肉均呈黑紫色的马铃薯品种，而“红宝石”马铃薯是一种表皮与果肉均呈红色的马铃薯品种，由于它们富含普通马铃薯所缺乏的花青素，同时VC、胡萝卜素等抗氧化物质含量显著高于普通马铃薯，使其兼具抗癌、抗衰老、美容和防止高血压等多种保健功能[2-3]。尤其是VC，它对人体正常生理代谢的平衡具有重要意义，同时还对缺铁性贫血、白内障和心血管疾病的防治起着重要作用[4]。但是，人体自身不能合成维生素C，而必须从外来食物中摄取，而维生素C广泛存在于果蔬中[5]。因此，测定彩色马铃薯中维生素C的含量，对更深刻了解和宣传彩色马铃薯的营养价值和保健功能具有重要的推动意义，也为以彩色马铃薯为原料开发各种营养丰富、健康、安全的食品奠定理论基础。

根据不同的原理，维生素C含量的测定方法有很多种，一般包括电化学法、紫外分光光度法、荧光法、酶法、比色法（2，4-二硝基苯肼比色法）、滴定法（碘滴定法、2，6-二氯靛酚钠滴定法）等。这些方法中，尤其是滴定法所需试剂较多，操作过程多而繁琐，测定过程中需要用到一些有毒、致癌物质，如碘化汞、2，4-二硝基苯肼、重铬酸钾等[6-8]。近年来，高效液相色谱法由于其高效、快速、稳定可靠的特点，被广泛应用于果蔬、食品、药物等中的维生素C含量的测定[9]，在马铃薯中VC的测定也有见报导[10]。但是，由于彩色马铃薯中含有大量的花青素、酚酸等有色物质，用经典二氯法无法测定其VC含量，而碘滴定法[11]、紫外分光光度法[12]、高效液相色谱法[13]可取得较好的效果。因此，必须采用特殊方法减少或排除其干扰。本研究的目的主要是对高效液相色谱分离条件进行优化，建立一种简便、快捷、稳定的彩色马铃薯中维生素C含量测定方法，并可应用于其它呈色物质维生素C的含量测定。同时，比较碘滴定法、紫外分光光度法、高效液相色谱法在测定彩色马铃薯中VC含量的优缺点，为有色物质中VC的测定提供技术和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

LC-20A高效液相色谱仪、SPD-M 20A二极管阵列检测器为、SIL-20A自动进样器为、LC-20A高压输液泵为：日本岛津公司；色谱柱为BDS-HYPERSIL-C18柱（5 μm，250 mm，4.6 mm）：美国Thermo公司；UV-2450紫外可见分光光度计：日本岛津公司；九阳（Joyoung）JYZ-V906原汁机：九阳股份有限公司；TP311台式精密酸度计：北京时代新维测控设备有限公司；ELGA超纯水机：北京莱特莱德公司。

1.1.2 试剂

超纯水由实验室制水机获得；维生素C标准对照品（优级纯，纯度为99.7%）：中国医药上海化学试剂公司；磷酸、甲醇（色谱纯）：中国医药集团化学试剂有限公司；草酸（分析纯）：贵州金摩尔化学有限公司；碘滴定法、紫外分光光度法所需的各种试剂均为国产分析纯试剂；黑美人、红宝石马铃薯：贵州省生物技术（马铃薯）研究所。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

将新鲜马铃薯洗干净，去皮，然后称取5 g剁碎，置于研钵中，加入2%草酸溶液5 mL，研磨成浆，然后转移至100 mL容量瓶中，用2%草酸洗涤研钵数次，然后用超纯水定容至刻度，充分混匀后过滤，计算所得滤液体积。吸取10 mL滤液于25 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度。样品分析前用0.45 μm滤膜过滤。

1.2.2 VC标准溶液的制备

准确称取VC标准品50 mg于50 mL烧杯中，用2%草酸溶液溶解，转移至50 mL棕色容量瓶中，稀释至刻度，得1 g/L VC标准液。检测前用2%草酸溶液分别配制质量浓度为20、40、60、80、100 mg/L VC标准溶液。

1.2.3 色谱检测条件

pH=2.5，流动相A为0.05 mol/L磷酸，流动相B为甲醇，A∶B=9∶1（体积比），流速为0.8 mL/min；检测波长为245 nm，进样量为10 μL，柱箱温度为32℃。

1.2.4 碘滴定法和紫外分光光度法测定VC含量

碘滴定法与紫外分光光度法分别参照陈曼云等[11]，朱兆富等[12]的方法，每种方法、每种样品均重复6次。

2 结果与分析

2.1 VC检测波长的选择

通过UV-2450日本岛津紫外可见分光光度计扫描VC标准液的吸收光谱，在245 nm处有最大吸收值，故本研究选择245 nm作为检测波长。

2.2 样品溶剂的选择

VC在空气中不稳定，受空气、热、光等因素影响，极易被氧化，尤其是在碱性环境中被氧化得更快，但是在酸性介质中，它受空气氧化的速度稍慢，较为稳定。2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，过高或过低浓度，抗坏血酸氧化酶的抑制效果均要减小[14]。因此，采用2%的草酸来配制VC标准溶液和提取样品中的VC是为了减慢它的氧化分解速度，降低测定结果误差。

2.3 流动相的选择

VC在酸性环境中能保持其较好的稳定性，另外，高浓度酸会腐蚀泵和柱子，减小其使用寿命，因此，本研究选择浓度为0.05 mol/L的磷酸溶液作为流动相；流动相中添加少量的甲醇可以起到加快出峰时间和缩短分析时间的作用，同时可改善色谱峰型。色谱最佳pH的选择和流动相（磷酸与甲醇）配比的选择参考侯璐等[9]的方法，分别选择为pH=2.5，A∶B=90∶10（体积比），流速为0.8 mL/min。

2.4 标准曲线的绘制

将配置好的各浓度标准溶液用0.45 μm滤膜过滤后，进样10 μL，测定VC标准溶液相对应的峰面积；然后以VC标品质量浓度与相对应峰面积分别作自变量和因变量，绘制标准工作曲线，结果如图1所示。

图1 维生素C标准品色谱图与标准工作曲线Fig.1 Standard work curve of Vitamin C

所得曲线方程为yb=5 622 000x+69 538，相关系数R2=0.999 9，表明曲线具有很好的线性关系。结果显示，本方法的线性范围较宽，在0.02 g/L～0.1 g/L范围内呈现较好的线性关系。以2倍基线噪声所对应的浓度，计算出本方法VC的检出限为0.002g/L。从VC标准品的色谱图中，可以看到两个谱峰。通过比较两个谱峰的峰面积，谱峰a（保留时间5.369 min）在各浓度的标准品溶液中的峰面积变化与VC质量浓度相关系数只有0.103，不呈现线性关系，而谱峰b（保留时间5.708 min）呈现较好的线性关系，因此可以断定，谱峰b是VC的测定谱峰。谱峰a可能是草酸的吸收峰。

2.5 维生素C含量的测定与精密度试验

同一马铃薯品种在相同试验条件下重复测定8次，测得黑美人马铃薯与红宝石马铃薯中VC平均含量分别为21.27、18.28 mg/100 g，测定结果见表1，两个马铃薯品种的VC色谱图见图2。

表1 彩色马铃薯维生素C含量测定结果及精密度（n=8）Table 1 The testing results and accuracy of vitamin C in color potatoes（n=8）

表1结果表明，精密度试验的标准偏差小于2%，表明该方法重复性较好。从色谱图中可以看出，维生素C大约在6min出峰，从而该法具有快速、灵敏的特点。

图2 黑美人与红宝石马铃薯维生素C的色谱图Fig.2 The chromatogram map of vitamin C from black beauty and red ruby potatoes

2.6 回收率试验

在同一组容量瓶中，分别加入等量的马铃薯样品，然后再分别加入不同量的VC标准溶液，测定其回收率，试验结果见表2。

表2 回收率试验结果Table 2 Recover rate of vitamin C

表2结果显示，黑美人马铃薯VC回收率为91.36%～99.82%，红宝石马铃薯回收率为89.82%～98.09%，符合定量分析中准确度的要求。

2.7 高效液相色谱法与紫外分光光度法、碘滴定法的比较

3种VC检测法测定彩色马铃薯VC含量的结果比较结果见表3。

表3 3种VC检测法测定彩色马铃薯VC含量的结果比较Table 3 The vitamin C content comparison among three kinds of determination methods

由表3可知，高效液相色谱法、紫外分光光度法、碘滴定法测得黑美人马铃薯中VC含量分别为21.27、19.92、23.31 mg/100 g，红宝石中VC含量分别为18.28、17.68、21.76 mg/100 g。

3 讨论

通过以上结果分析，表明本试验采用的高效液相色谱法是可靠的，试验过程中没有用到特殊试剂，样品提取简单快捷，从而可减少VC的氧化损失。因此，可以避免比色法、滴定法等检测有色样品过程中易出现数据偏离、检测值偏高等问题。结果重现性好，准确度及回收率高，可用于彩色马铃薯及其制品中VC含量的测定，具有较好的实际应用价值。高效液相色谱法已广泛应用于植物及药剂中VC含量的测定，如刺梨[9]、草莓[13]、番茄[15]等。不同点在于它们所使用的流动相和提取剂有差异，但是均有一个共同的特点，即保持VC在一个酸性环境中，所使用的试剂均为酸性物质，以维持VC的稳定性[14]。如刺梨VC测定中，用的提取剂是1 mg/mL偏磷酸，流动相为0.05 mol/L磷酸[9]；草莓中VC测定采用的提取剂与流动相均为0.1%草酸[13]。本实验所采用的提取剂为2%草酸，流动相为0.05 mol/L磷酸，取得较好的分离和测定效果。

由于VC对在光环境中不稳定，且遇氧易分解，因此本试验全程应注意避光操作，样品处理及检测应在最短时间内完成；本试验均使用棕色容量瓶定容[16]；流动相、样品和标准品提取试剂均使用2%的草酸，获得较好的分离效果，且样品处理过程操作简便，试验程序简化；流动相均需色谱纯试剂，水为超纯水，注意流动相在脱气后尽量不引起气泡；流动相溶液pH选择2.5，其值在色谱柱最适宜的操作范围之内，但由于酸度较低，为防止色谱柱酸化，延长色谱柱使用寿命，色谱柱在使用完毕需用超纯水清洗30 min，然后用甲醇冲洗30 min；所有过柱子的液体均需严格的过滤；清洗压力不宜过大，控制在15 MPa以内为佳。

同葡萄汁、草莓等水果一样，黑美人马铃薯与红宝石马铃薯VC提取液中，含有很深的有色物质，用传统的2，6-二氯靛酚钠滴定法对深色样品测定时，因颜色的干扰而难以判定终点，故不适用于深色果蔬样品的测定[17]。对于深色果蔬样品中VC含量的测定，目前常用的方法有电位滴定法[17]、碘滴定法[11]、紫外分光光度法[12]、高效液相色谱法[13]等。采用紫外分光光度法时，由于深色物质中有些成分（主要是有机酸、多糖等）在紫外区也有吸收光谱，对测定结果的准确性产生较大的影响，因此，测定时须对样品紫外区本底吸收进行校正，方式包括降低Cu2+浓度、加热等[12]。本研究，比较分析了高效液相色谱法、紫外分光光度法、碘滴定法测定彩色马铃薯中VC含量的准确性差异，结果表明，用这3种方法测得黑美人马铃薯中VC含量分别为21.27、19.92、23.31 mg/100 g，红宝石中VC含量分别为18.28、17.68、21.76 mg/100 g。经甘肃省农业科学院农业测试中心检测（理论值），黑美人和红宝石马铃薯中维生素C含量分别为21.73、18.74 mg/100 g，表明高效液相色谱法所测得结果与理论值较相符；紫外分光光度法所测结果与理论值相差不大；碘滴定法所测VC含量要高于理论值，分析的原因是滴定过程中颜色变化不好判定，影响其测定准确性[9]。综上所分析，表明高效液相色谱法可快速、灵敏、准确、稳定的对彩色马铃薯中的维生素C进行测定。

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Determination of Vitamin C in Colorful Potatoes by High Performance Liquid Chromatography

WANG Hui，LIU Hui，LIU Jia，LÜ Du，LI Jun，CHEN Chao-jun，DONG Nan，TANG Jian-bo，CHEN Zhong-ai，LIU Yong-xiang*
（Institute of Guizhou Biotechnology，Guizhou Academy of Agriculture Science，Guiyang 550006，Guizhou，China）

A rapid method for determination of vitamin C in colorful potato species Solanum tuberosum black beauty and red ruby was established by high performance liquid chromatography（HPLC）.Vitamin C in potatoes was extracted by 2%oxalic acid，then separated through a C18chromatographic column with the phosphoric acid-methanol buffer（0.05 mol/L，pH2.5）as the mobile phase.Thereafter，the vitamin C was detected by ul traviolet-visible detector at the wavelength of 245 nm.The absorbance in samples was compared with the standard substance，which qualitative determination was according to the retention time，and quantitative determination was according to the peak area.The results showed that the linear range of the present method was 0.02 g/L-0.1 g/L，the detection limit was 0.002 g/L，and the linear equation was yb=5 622 000x+69 538，the related coefficient was 0.999 9.After the recovery experiment，the recoveries were 97.61%-99.81%，97.28%-99.82%，respectively，and the relative standard deviation were 0.90%，1.02%，respectively.The VCcontent in black beauty was（21.27±0.19），（19.92±0.13），（23.31±0.11）mg/100 g by HPLC，UV spectrophotometry，Iodometric method，respectively.And（18.28±0.19），（17.68±0.14），（21.76±0.09）mg/100 g in red ruby，respectively.Comparedwith the results from agricultural test center of Gansu academy of agricultural sciences（21.73 mg/100 g in black beauty；18.74 mg/100 g in red ruby），the results of HPLC was preciser than the other two methods.The method can well be applied in the determination of vitamin C content with the features of rapid，sensitive，exact and stable，and applicable to detection of vitamin C in fruits and vegetables，such as strawberry，roxburgh rose and green vegetables.

high performance liquidchromatography；Solanum tuberosum black beauty；Solanum tuberosum redruby；vitamin C

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.12.028

2016-10-10

贵州省重大科技专项计划项目“马铃薯主食化加工关键共性技术研究及产业化开发”（黔科合重大专项字[2014]6016号）；贵州省科技基础条件平台项目“贵州省农业生物技术重点实验室开发实验平台建设”（黔科平台[2015]4007）；贵州省农科院科技成果培育与人才培养项目“贵州省薯芋类加工研发建设”（黔农科院院专项[2014]38号）

王辉（1989—），男（汉），助理研究员，硕士，主要从事食品加工方面的工作。

*通信作者：刘永翔（1978—），女，研究员，博士，研究方向：农产品加工。