脑梗死患者凝血因子Ⅻ Exon1-46C/T基因多态性

徐琦煜，金艳慧，刘媚娜，刘欢乐，王明山

（温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015）

脑梗死患者凝血因子Ⅻ Exon1-46C/T基因多态性

徐琦煜，金艳慧，刘媚娜，刘欢乐，王明山

（温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015）

目的：探讨凝血因子X II（FX II）基因Exon1-46C/T多态性与脑梗死的相关性及对机体纤溶功能的影响。方法：采用直接测序法测定脑梗死组（60例）与正常对照组（60例）的FX II基因46C/T多态性，同时采用自动血凝仪测定FX II活性（FX II∶C）、纤溶酶原活性（PLG∶A）、纤维蛋白原（FIB）及D-二聚体（D-D）含量等指标。结果：脑梗死组比正常对照组中46TT明显升高，且2组间多态性分布比较差异有统计学意义（P＜0.05）。通过基因型单因素分析，脑梗死患者中T等位基因危险性是C等位基因的1.865倍，TT基因型危险性为结合（CC+CT）基因型的3.021倍。与正常对照组比较，脑梗死组46TT基因型FX II∶C明显下降，D-D含量升高，PLG∶A下降（P＜0.05），但脑梗死患者FX II多态性各型之间的D-D指标差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：FX II基因46TT多态性与脑梗死的发生有关联，其可导致FX II活性明显下降，致使机体的纤溶功能受影响。

脑梗死；凝血因子X II；多态性；纤溶功能

脑血管病是当前严重危害人类生命与健康的常见病，是中老年人致死、致残的主要原因之一，其中脑梗死约占2/3。脑梗死是一种多基因病[1]，其发病在一定程度上受各种相关基因间及基因与环境间相互作用的影响[2]。目前已发现与脑梗死相关的基因多态性有20余种，由凝血相关因子基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNPs）引起的功能变化与脑梗死有密切关系[3]。其中凝血因子X II（FX II）不仅是内源性凝血途径的启动因子，同时也参与纤溶途径的激活[4]。在FX II基因启动子区第46位核苷酸存在一个常见的多态性C→T（FX II46C→T），可引起FX II活性的降低或缺失而不能有效激活纤溶系统[5]。本研究通过检测脑梗死患者FX II基因多态性及凝血、纤溶功能指标变化，初步探讨FX II基因46C/T多态性对脑梗死发病的影响及其机制。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2015年8月至2015年12月在温州医科大学附属第一医院就诊的脑梗死患者60例（脑梗死组），其中男45例，女15例，年龄31～92岁，平均（62.9±13.3）岁，诊断符合全国第四届脑血管学术会议（1995）通过的脑梗死诊断标准，均经头颅CT或MRI检查确诊为脑梗死，患者发病24 h内，均为首次发病，入院前及采集血液标本前均未使用任何抗凝、溶栓等有关药物，且无合并深静脉血栓等，并排除肝脏疾病。正常对照组60例，其中男40例，女20例，年龄26～78岁，平均（59.2±12.6）岁，均为同期健康体检者，无心脑血管及肝脏疾病，无高血压、糖尿病及血栓性疾病史。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及DNA抽提：采集脑梗死组及正常对照组足量静脉血于含0.109 mol/L枸橼酸钠抗凝剂的真空采血管中，颠倒混匀后3 000 r/min离心10 min，得乏血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP）。下层血细胞用于基因抽提。基因组DNA提取试剂盒购自上海荻硕贝肯生物科技有限公司。

1.2.2 血浆凝血纤溶指标的检测：采用凝固法检测FX II活性（FX II∶C）和纤维蛋白原（FIB）含量、发色底物法检测纤溶酶原活性（PLG∶A）、免疫比浊法检测D-二聚体（D-D）含量，各指标检测均在法国Stago-STA自动血凝仪上进行（配套试剂由法国Stago公司提供），所有操作步骤均严格按照试剂说明书进行。

1.2.3 FX II基因第46位多态性直接测序：用上述DNA提取试剂盒抽提基因组DNA，根据FX II基因序列（GenBank AF538691），应用primer5软件设计覆盖FX II基因启动区第46位碱基的1+2外显子区域及其侧翼序列的引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游：5’-AGGGCAGCTTGACCAATC-3’，下游：5’-GAGGAGCCAGGCCACTTA-3’。PCR试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，PCR扩增如下：95 ℃预变性5 min，后95 ℃变性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物原液送上海生工生物工程有限公司测序。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析。多组间比较采用方差分析。各组间基因多态性频数分布分析及比较采用χ2检验，并计算OR值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组FX II基因多态性分布及相对危险度分析 脑梗死组中男45例，女15例，其中男性46T/T、C/T、C/C分别为23例、18例、3例；女性分别为11例、2例、2例，其基因型性别分布无显著性差异。脑梗死组与正常对照组FX II基因Exon1-46TT、CT、CC型分布频率，2组间比较差异有统计学意义（χ2=8.448，P＜0.05），且脑梗死组的46TT多态性高于正常对照组，基因频率分布符合Hardy-weinberg平衡定律（χ2= 0.291，P＞0.05）。通过基因型单因素分析，脑梗死组与正常对照组C、T等位基因频率差异有统计学意义（χ2=4.929，P＜0.05，OR=1.865），即T等位基因危险性是C等位基因的1.865倍。因CC基因型例数较少，TT基因型与结合（CC+CT）基因型比较差异有统计学意义（χ2=8.620，P＜0.05，OR=3.021），TT基因型危险性为结合（CC+CT）基因型的3.021倍，见表1。

表1 脑梗死组与正常对照组FXII基因46C/T多态性频数分布及分析[ n（%）]

2.2 脑梗死组患者FXII多态性对纤溶功能的影响

脑梗死组46TT型FX II∶C明显低于46CT型、46CC型及正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），46CT型FX II∶C低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），且46TT型与46CT型、46CC型间FX II∶C比较差异有统计学意义（P＜0.05）。脑梗死组46TT型的PLG∶A含量低于正常对照组及46CC型，差异有统计学意义（P＜0.05），且46TT型的D-D含量高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），在46CT型和46CC型的脑梗死组中D-D含量也高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），但脑梗死组的FX II基因多态性各型之间D-D差异无统计学意义（P＞0.05）。脑梗死组FXII基因多态性各型组及正常对照组之间的FIB差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

3 讨论

脑梗死是指因脑部血液供应障碍、缺血、缺氧所致的局限性脑组织的缺血性坏死或软化。脑梗死作为一种突发性脑部疾病可发生于任何年龄段。FX II是机体内源性凝血途径的启动因子，同时也是纤溶系统的激活物。在FX II基因Exon1-46位存在C→T置换，形成46C/T基因多态性位点，因而在人群中可存在3种基因型：46CC、46CT、46TT。这个多态性位点出现在5’端非翻译区、ATG起始密码子的上游4个碱基处，当C被T替换后，产生了一个新的ATG起始密码子，因此，FX II基因Exon46C→T置换导致了翻译效率的下降。即便在FX II46T基因中产生新的起始密码子，原始的起始密码子依然可以识别进行翻译，只不过产生FX II的量与FX II46C基因相比可能要降低[6]，因此，此基因多态性使FX II血浆水平下降，而FX II血浆水平是血栓形成的关联性表型及危险因素[7]。

表2 脑梗死患者FX II基因多态性对纤溶功能的影响及比较（）

表2 脑梗死患者FX II基因多态性对纤溶功能的影响及比较（）

与正常对照组比：aP＜0.05；与46CT型比：bP＜0.05；与46CC型比：cP＜0.05

组别 例数 FX II∶C（%） FIB（g/L） D-D（mg/L） PLG∶A（%）正常对照组 60 99.2±22.5 3.00±0.50 0.20±0.11 116.2±13.1脑梗死组46TT 35 56.4±15.9abc3.22±0.71 1.15±1.13a94.3±18.4ac46CT 20 71.3±15.3a3.19±0.51 1.01±0.44a100.5±12.6 46CC 5 81.3±18.9 3.60±1.10 0.88±0.65a110.6±14.2

国内外对脑梗死患者与FX II基因多态性研究有较多报道，但是结论各不相同，仍存在着争议。其中张玲等[8]认为46CC可能是脑血栓形成的危险因素，而本研究结果显示，TT型在脑梗死患者中比例更高，而且46TT型的FX II∶C明显低于46CT、46CC型及正常对照组，因此脑梗死患者的FX II∶C更低，增加了血栓形成的危险。同样基因型单因素分析显示，T等位基因危险性是C等位基因的1.865倍，即OR=1.865，差异有统计学意义。也有研究[9]认为，因46CC基因型例数较少，可以将46TT基因型与结合46（CC+CT）基因型比较，本研究发现前者危险性为后者的3.021倍，差异有统计学意义。因此本研究认为46TT或T等位基因升高是脑梗死的易感因素。SANTAMARIA等[10]也同样在西班牙人群中确定了FX II基因T/T基因型与缺血性脑卒中发病有相关性。而KLEINSCHNITZ等[11]报道FX II缺乏或抑制FX II活性可使实验小鼠的脑缺血损伤得到改善，FX II对于生理状态下的凝血过程并未发挥作用，只是选择性地作用于病理状态下的血栓形成。

在纤溶系统中，FX II与组织性纤溶酶原激活剂和尿激酶型纤溶酶原激活剂具有同源性的丝氨酸结构，可以直接或间接激活纤溶酶原，生成纤溶酶，以此激活纤溶系统[12]。血管内皮受损和血小板在体内被活化是动脉血栓形成的主要原因，此时也会产生少许的纤维蛋白黏附在血管壁上，如机体纤溶功能正常，就会及时清除这些纤维蛋白，使其不至于导致血栓形成。本研究脑梗死组46TT型FX II∶C明显降低，致使机体的纤溶功能不能正常发挥，因此更易导致血栓形成。脑梗死组46TT型的PLG∶A含量低于正常对照组及46CC型，进一步显示了FX II∶C与纤溶功能有关联，其机理有待进一步探讨。FIB为凝血的基础物质，其水平增高提示体内凝血功能增强，易导致静脉血栓形成，本研究脑梗死患者FX II基因多态性各基因型及正常对照组之间的FIB差异无统计学意义，说明在本研究中FIB不是动脉血栓形成的主要因素。病理状态下，机体发生凝血时，凝血酶作用于纤维蛋白，转变为交联纤维蛋白，同时纤溶系统被激活，降解纤维蛋白形成各种碎片，γ链能把2个含D片段的碎片连接起来形成D-D。D-D水平的上升反映了体内存在着凝血和纤溶活性增强的重要分子标志物，因此它既可反映体内存在着血栓或血栓继续形成的状况，又可反映体内继发性纤溶活性增强。通常脑梗死属于动脉血栓形成或栓塞，而动脉血栓主要是白色血栓，因此D-D水平变化的敏感性不如静脉血栓形成性疾病。本研究结果显示，在脑梗死组中46TT、46CT、46CC 3种基因型中D-D的含量均高于正常对照组，但3组之间差异无统计学意义，表明在脑梗死患者中均存在继发性纤溶活性的增强，而反映不出与FX II基因多态性有关联。

综上所述，FX II基因46TT多态性与脑梗死的发生有关联，其可导致FX II活性明显下降，致使机体的纤溶功能受影响。

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（本文编辑：吴彬）

Research of factor XII gene Exon1-46C/T polymorphism in cerebral infarction patients

XU Qiyu, JIN

Yanhui, LIU Meina, LIU Huanle, WANG Mingshan.
Laboratory Medicine Center, the First Af fi liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To investigate the correlation and fi brinolysis in fl uence of factor XII gene (FXII) polymorphism on the patients with cerebral infarction. Methods: Direct sequencing was used to analyze the 46 polymorphism at promoter regions in factor XII gene among cerebral infarction patients and healthy controls. Meanwhile, the activity of plasma factor XII (FXII:C), fi brinogen (FIB), D-dimer (D-D) and the activity of plasminogen (PLG:A) were measured. Results: The rate of 46TT of factor XII gene (FXII) polymorphism in patients with cerebral infarction was higher than that in healthy controls, and the differences on the distribution were statistically signi fi cant (P＜0.05). By analysis of genotype single factor, the risk of T genotype was higher 1.865 times than that of C genetype and the risk of TT genotype was higher 3.021 times than that of (CC+CT) unite genotype in the cerebral infarction patients. Compared with the healthy controls, the FXII:C and PLG:A were obviously lower and D-D were higher in 46TT group (P＜0.05), and there were no differences of D-D in these groups. Conclusion: The FXII gene 46TT polymorphism is obviously increased in patients with cerebral infarction, and it can lead to evidently decreased the activity of FXII, then affects the body’s fi brinolysis.

cerebral infarction; factor XII; polymorphism; fi brinolysis

R743.33

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.013

2016-05-17

温州市科技计划项目（Y20150306）。

徐琦煜（1984-），女，浙江温州人，主管技师。