前列腺增生后不稳定膀胱致逼尿肌肌聚糖表达变化

木海琦，朱诗建，王帅彬，南存金，包云帆，陈映鹤

（1.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 泌尿外科，浙江 温州 325027；2.温州医科大学附属苍南医院 泌尿外科，浙江 温州 325800）

・临 床 经 验・

前列腺增生后不稳定膀胱致逼尿肌肌聚糖表达变化

木海琦1，朱诗建2，王帅彬1，南存金1，包云帆1，陈映鹤1

（1.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 泌尿外科，浙江 温州 325027；2.温州医科大学附属苍南医院 泌尿外科，浙江 温州 325800）

目的：探讨良性前列腺增生（BPH）后不稳定膀胱导致膀胱逼尿肌肌聚糖（SG）表达变化。方法：对BPH后稳定膀胱组患者34例、BPH后不稳定膀胱组患者26例，采用免疫组织化学染色法、Western blot法检测膀胱壁逼尿肌中SG的α、β、γ 3种亚基蛋白表达情况，RT-PCR法检测SG的α、β、γ 3种亚基mRNA表达水平。结果：SG在BPH后不稳定膀胱组的平均表达水平较稳定膀胱组增加，差异有统计学意义（P＜0.05)。结论：BPH后膀胱逼尿肌不稳定性可能与SG改变有关。

良性前列腺增生；不稳定膀胱；肌聚糖

前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）后膀胱也发生相应改变，出现逼尿肌结构、功能及神经支配的变化，引起膀胱不稳定收缩，表现为尿频、尿急、急迫性尿失禁等一系列症状[1]。肌聚糖（sarcoglycan，SG）是肌肉收缩相关的功能蛋白，既往研究[2-4]发现其与心肌、骨骼肌、血管平滑肌等功能变化相关。本课题组前期研究[5]发现当膀胱逼尿肌收缩力下降时，逼尿肌内SG表达将出现显著下降。本研究通过检测膀胱逼尿肌SG表达，探讨其在BPH所致不稳定膀胱逼尿肌中发生的变化。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2014年6月至2015年4月因BPH住院手术的患者。根据尿动力检查中膀胱充盈时是否出现膀胱压力≥1.47 kPa，且不能被主动抑制的逼尿肌不自主收缩，将患者分为稳定膀胱组（稳定组）34例，年龄59～88岁，平均（71.23±5.24）岁；不稳定膀胱组（不稳定组）26例，年龄61～90岁，平均（73.17±6.31）岁。2组年龄无明显差异且均无影响膀胱功能的疾病。本研究经医院伦理委员会审查，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂 兔抗人α-SG单克隆抗体、鼠抗人β-SG单克隆抗体、兔抗人γ-SG多克隆抗体购自美国Abcam公司；TrizolTM试剂盒购自美国Gibco公司；SYBR Green荧光染料购自美国Roche公司；Prime-Script RT reagent Kit购自日本Takara公司。

1.3 方法

1.3.1 标本的收集与处理：2组患者均采取耻骨上前列腺摘除术，术中取膀胱前壁全层。剔除黏膜及其他组织后一份置入液氮保存，一份常规脱水透明后，石蜡包埋切片。

1.3.2 免疫组织化学SP法检测SG 3种亚型（α、β、γ）表达：按照试剂盒说明书操作，切片常规脱蜡，枸橼酸盐修复，经3% H2O2阻断过氧化物酶活性及山羊血清封闭后，滴加按比例稀释后的一抗，4 ℃过夜，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，镜检观察。在光学显微镜下每张切片随机选取10个视野采集图像，应用Image Pro Plus软件分析阳性区域，计算积分密度值（IOD）来反映阳性蛋白的强度或浓度。

1.3.3 Western blot法检测SG 3种亚型表达：用含PMSF的蛋白裂解液提取组织中蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取50 μg蛋白煮沸变性后，进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。加入一抗，4 ℃冰箱摇床过夜，加入相应二抗，ECL化学发光、显影、定影。Bio-Rad Quantity软件分析测定其区带的吸光度，GAPDH为内参，目的片段与GAPDH的吸光度比值表示蛋白表达水平。

1.3.4 RT-PCR法检测SG 3种亚型mRNA表达：组织块解冻后置于1 mL Trizol抽提试剂中充分裂解，在抽提时加入200 μL氯仿，并采用预冷处理后75%乙醇洗涤RNA沉淀，溶于DEPC水中，保存于-80 ℃备用。根据反转录试剂盒说明书进行RNA反转录。反转录反应条件：25 ℃ 10 min；42 ℃ 60 min；52 ℃15 min；70 ℃ 15 min；终止反应，所得cDNA溶液置冰中5 min后-20 ℃保存。由上海基康公司设计合成引物，使用SYBR GreenI RT PCR反应体系扩增。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min后，95 ℃ 10 s；60 ℃ 10 s；72 ℃ 10 s，40个循环。

1.4 统计学处理方法 应用SPSS17.0统计软件进行统计处理。数据采用表示，2组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SG 3种亚型免疫组织化学染色结果 SG蛋白免疫阳性产物呈棕黄色颗粒，主要位于细胞浆，光镜下可见与膀胱逼尿肌细胞走向一致。与稳定组相比，不稳定组中棕黄色阳性染色比例均升高，表明该组膀胱壁中的SG 3种亚型（α、β、γ）蛋白表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1和表1。2.2 SG 3种亚型Western blot检测结果 经Western blot半定量检测SG表达量，与稳定组相比，不稳定组中SG 3种亚型（α、β、γ）表达量均升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图1 SG 3种亚型（α、β、γ）在膀胱组织中的表达情况（×400）

表1 SG蛋白在不同组中的IOD（）

表1 SG蛋白在不同组中的IOD（）

与稳定组比：aP＜0.05

组别 例数 α-SG β-SG γ-SG稳定组 34 192.37±34.92 261.48±48.78 104.05±30.66不稳定组 26 525.16±58.37a593.28±49.98a442.31±39.82a

图2 SG 3种亚型表达情况

2.3 SG 3种亚型mRNA表达情况 经RT-PCR仪扩增，不稳定组SG 3种亚型的mRNA相对表达量分别为2.32±0.45、2.02±0.39、2.57±0.74；稳定组分别为0.79±0.26、0.52±0.12、1.21±0.53，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

BPH是引起中老年男性排尿功能障碍最为常见的良性疾病之一，其中不稳定膀胱是其重要的病理生理改变[1]。1987年国际尿控学会（International Continence Society，ICS）将不稳定膀胱定义为在膀胱充盈时出现自发或被诱发的膀胱压力大于或等于1.47 kPa且不能被主动抑制的膀胱逼尿肌不自主收缩[6]。有52%～80% BPH患者出现不稳定膀胱表现。但目前对不稳定膀胱的病因机制尚无定论，治疗效果并不理想。膀胱是一种顺应性良好的空腔器官，在充盈和排空时膀胱壁能够自我调节伸展、重构以适应膀胱容量的改变，而不引起明显的膀胱内压改变。当BPH后引起膀胱不稳定收缩时，膀胱的一系列生物力学特征就发生了改变，这一过程包括了很多中间环节，如胆碱能神经超敏化、肾上腺受体改变等，其中逼尿肌本身是一重要的改变因素[7]。

在骨骼肌及心肌的肌膜上存在着抗肌萎缩相关蛋白复合体，称为DGC复合体，该复合体为一种跨膜复合体，能将单个肌细胞通过“肌丝相互滑动”产生的力传递到细胞外基质，整合后形成肌肉收缩[8-9]。而SG是DGC复合体的主要成分之一，是一种黏附分子，能维持肌膜组织结构的稳定性及Ca2+平衡[10]。ANASTASI等[11]在胃肠道等组织器官中发现了SG，泌尿系器官均属于平滑肌器官，理论上也应该存在该蛋白。ARENA等[12]研究发现原发性膀胱输尿管反流可能与SG过表达后平滑肌功能亢进相关，但具体机制尚待明确。我们前期通过建立雄兔膀胱出口梗阻模型，当梗阻达到一定时间后，逼尿肌中β、γ-SG蛋白表达下降[13]，而人BPH后造成膀胱收缩力的下降同样与该蛋白表达下调有关[5]。

本研究发现SG上调可能与逼尿肌不稳定相关。膀胱逼尿肌组织与胃肠道等平滑肌一样，其收缩主要依赖于细胞浆中Ca2+与粗肌丝中肌球蛋白结合而触发[14]，而SG具有维持Ca2+平衡的作用。因此我们推测这种改变容易导致不稳定膀胱的发生，其可能的机制是：随着SG表达上调，膜外的Ca2+进入细胞内增多，引起细胞内肌浆网中Ca2+进一步释放，从而导致膀胱逼尿肌细胞具有更高的兴奋性，从而引起不稳定收缩，导致患者尿频、尿急以及急迫性尿失禁等临床症状。但具体通过何种方式相联系，尚需更深一步研究加以明确。

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（本文编辑：赵翠翠）

The expression change of sarcoglycan in the detrusor muscle of unstable bladder caused by benign prostatic hyperplasia

MU Haiqi1, ZHU Shijian2, WANG Shuaibin1, NAN Cunjin1, BAO Yunfan1, CHEN Yinghe1.

1.Department of Urology, the Second Af fi liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Urology, Cangnan Hospital Af fi liated to Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325800

Objective: To study the expression change of sarcoglycan (SG) in the detrusor muscle of the unstable bladder caused by benign prostatic hyperplasia (BPH). Methods: 34 cases of stable bladder and 26 cases of unstable bladder were included in this study. The expressions of α-SG, β-SG, γ-SG in detrusor muscle of bladder were detected by immunohistochemical technique Western-blot and RT-PCR. Results: Compared to the group of stable bladder, the expression of SG in detrusor muscle of unstable bladder caused by BPH was increased (P＜0.05). Conclusion: The changes of SG in the detrusor muscle of bladder may closely related to the production of unstable bladder caused by BPH.

benign prostatic hyperplasia; unstable bladde; sarcoglycan

R69

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.011

2016-06-13

温州市公益性科技计划项目（Y20150219）。

木海琦（1982-），男，浙江温州人，主治医师，硕士。

陈映鹤，主任医师，Email：chenyh@wzhealth.com。