微淋巴管密度和微血管密度与乳腺癌患者临床病理特征的相关性

吕可君

（永康市第一人民医院 病理科，浙江 金华 321300）

微淋巴管密度和微血管密度与乳腺癌患者临床病理特征的相关性

吕可君

（永康市第一人民医院 病理科，浙江 金华 321300）

目的：观察乳腺癌组织中微淋巴管和微血管的分布情况及其与乳腺癌临床病理特征的相关性。方法：选取60例乳腺癌患者作为病例组，按年龄匹配选取60例乳腺增生性疾病患者作为对照组。采用D2-40、CD34分别标记2组患者组织标本的微淋巴管和微血管后进行密度计数，对微淋巴管密度和微血管密度与临床病理特征的相关性进行分析。结果：病例组微淋巴管密度平均值为5.32±3.81，微血管密度平均值为65.34±24.18。病例组D2-40蛋白表达水平和CD34蛋白表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。微淋巴管密度和微血管密度与乳腺癌患者年龄无关（P＞0.05），与肿瘤直径、临床分期、淋巴结转移有关（P＜0.05），乳腺癌组织中微淋巴管密度与微血管密度成正相关（r=0.684，P＜0.05），微淋巴管高密度组和低密度组之间、微血管高密度组和低密度组之间患者的生存时间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：微淋巴管密度和微血管密度与乳腺癌患者肿瘤直径、临床分期、淋巴结转移密切相关，与预后无明显相关性，与乳腺癌复发和远处转移密切相关。

微血管；微淋巴管；乳腺肿瘤；临床病理特征

乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，近年发病呈逐年上升趋势，严重威胁患者健康和生命。随着乳腺癌基础与临床研究的不断深入，乳腺癌治疗取得很大进步，但转移和复发仍是造成乳腺癌患者死亡的主要原因，也是当今乳腺癌的研究热点。血管和淋巴管生成在癌组织的生长、浸润和转移扩散中起了极其重要的作用，但癌细胞如何通过微淋巴管和微血管转移还存在争议[1-2]。癌细胞是通过已经存在的血管和淋巴管还是新生成的血管和淋巴管发生转移，癌病灶内还是癌病灶周围的血管和淋巴管对患者的预后产生影响目前尚未明确[3-4]。本研究通过免疫组织化学法检测癌组织中微淋巴管密度（D2-40标记）和微血管密度（CD34标记），探讨乳腺癌组织中微淋巴管和微血管分布情况及其与临床病理特征之间的关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择2010年1月至2012年12月在本院住院治疗的乳腺癌患者作为研究对象。纳入标准：①病理确诊为乳腺癌，所有患者均接受手术治疗，术前未进行抗癌治疗，预计生存期大于6个月；②患者签署知情同意书，自愿参加，依从性较好，能接受随访。排除标准：①入院前接受过手术治疗、抗癌治疗等；②拒绝随访者。符合纳入标准的患者共60例，年龄31～60岁，中位年龄48.6岁，平均年龄（49.2±14.2）岁。临床分期：I期8例， II期32例，III期14例，IV期6例。按年龄匹配在本院选60例行手术治疗的乳腺增生性疾病患者作为对照组。本研究经本院伦理委员会审核批准，所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 微血管密度和微淋巴管密度检测：采用D2-40、CD34分别标记2组患者组织标本的微淋巴管和微血管，免疫组织化学Elivision TM plus二步法[5]检测病例组乳腺癌组织和对照组增生组织中的D2-40蛋白、CD34蛋白和微血管计数、微淋巴管计数。Elivision TM plus二步法检测试剂购自福州迈新生物技术开发有限公司。DAB显色试剂购自北京中杉生物技术公司。2组患者手术标本均使用4%甲醛进行固定并脱水，使用石蜡包埋方法进行处理，然后进行切片。具体操作按照试剂盒附带的实验操作步骤进行。使用已知的CD34蛋白阳性切片作为阳性对照，使用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.2 结果判断：①微血管密度：采用Weidner方法计数CD34蛋白标记，即先在40倍镜下选择高血管密度区（热点区）计数，然后在200倍视野下计数被染成棕黄色的血管数目。②微淋巴管密度：采用Weidner法计数D2-40蛋白标记，先在低倍镜下寻找新生脉管最密集的区域，然后在高倍镜下对微淋巴管进行计数，在肿瘤组织内以5个高倍镜视野脉管的平均数表示微淋巴管密度。

1.2.3 随访：由经过培训的随访员通过电话、定期回院复查等途径进行随访，以患者手术日为随访起点，每位患者随访3年，随访截止时间为2015年12月31日。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析。计量资料以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，微淋巴管密度与微血管密度的关系采用pearson相关性分析。 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 D2-40标记的微淋巴管密度及CD34标记的微血管密度 D2-40标记的淋巴管呈一致性的管腔结构，染色呈棕黄色，表现为一层薄壁，管腔内很少有淋巴细胞，无红细胞（见图1A）。D2-40标记的微淋巴管密度平均值为5.32±3.81，中位数为4.1，以中位数为分界值，将微淋巴管密度≥4.1定义为高密度组，＜4.1为低密度组，其中高密度组34例，低密度组26例。CD34标记的微血管可见染色清晰的血管内皮细胞，呈棕黄色至深褐色弥散性分布，管腔大小不一（见图1B）。CD34标记的微血管密度平均值为65.34±24.18，中位数为58.74，以中位数为分界值，将微血管密度≥58.74定义为高密度组，＜58.74的为低密度组，其中高密度组32例，低密度组28例。对照组D2-40标记的淋巴管很少，未见棕黄色染色；CD34标记的微血管也较少，基本没有棕黄色或褐色染色。

图1 免疫组织化学染色结果

2.2 2组D2-40和CD34蛋白表达水平的比较 病例组患者乳腺癌组织中D2-40蛋白表达水平和CD34蛋白表达水平明显高于对照组增生组织，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 微淋巴管密度和微血管密度与临床病理特征的关系 微淋巴管密度和微血管密度与乳腺癌患者年龄无关（P＞0.05），与患者肿瘤直径、临床分期、淋巴结转移有关（P＜0.05），见表2。

2.4 微淋巴管密度与微血管密度的关系 Pearson相关性分析显示，乳腺癌组织中微淋巴管密度与微血管密度成正相关（r=0.684，P=0.011）。

2.5 微淋巴管密度和微血管密度与预后的关系 微淋巴管高密度组和低密度组之间、微血管高密度组和低密度组之间乳腺癌患者的生存时间差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表1 2组D2-40和CD34蛋白表达水平比较（）

表1 2组D2-40和CD34蛋白表达水平比较（）

与对照组比：aP＜0.05

组别 例数 D2-40 CD34对照组 60 2.11±0.82 16.84± 4.83病例组 60 5.32±3.81a65.34±24.18a

表2 微淋巴管密度和微血管密度与临床病理特征关系（）

表2 微淋巴管密度和微血管密度与临床病理特征关系（）

项目 例数 微淋巴管密度 t/F P 微血管密度 t/F P年龄（岁） 0.293 0.769 0.229 0.819＜35 16 5.12±3.64 63.17±24.86≥35 44 5.43±3.58 64.82±24.21肿瘤直径（cm） 2.312 0.014 3.125 0.004≤2 21 4.48±2.86 61.82±26.44＞2 39 6.68±2.92 65.97±27.28临床分期 3.867 0.008 2.889 0.012 I 8 3.74±2.63 62.36±21.87 II 14 5.83±2.26 63.98±24.63 IV 6 6.49±2.66 62.17±22.41淋巴结转移 4.027 ＜0.001 2.036 0.042有25 5.86±2.12 68.79±26.33无35 3.62±2.13 55.12±24.63 32 5.22±2.18 63.84±23.47 III

表3 微淋巴管密度和微血管密度与预后的关系（）

表3 微淋巴管密度和微血管密度与预后的关系（）

项目 例数 生存时间（月） t P微淋巴管密度 0.337 0.736低密度 26 36.2±2.4高密度 34 36.4±2.1微血管密度 0.920 0.358低密度 28 36.2±2.7高密度 32 36.8±2.3

3 讨论

目前乳腺癌治疗采用以手术切除为主的综合治疗，随着早期筛查的开展和诊断技术的提高，其治疗效果得到明显提升，患者生存期得以延长，但肿瘤的复发转移仍是乳腺癌患者治疗失败和死亡的主要原因。经淋巴管和血管转移是乳腺癌转移最常见的途径，乳腺癌细胞远处转移不仅影响乳腺癌的临床分期、治疗方案的选择，而且对治疗效果及预后有极其重要的预测作用[6]。因此，对淋巴管、血管转移的相关因素如微淋巴管及微血管生成的研究已经成为近年研究的热点。新生微淋巴管和微血管在乳腺癌浸润、转移、复发等过程中发挥重要的作用，通过检测微淋巴管密度和微血管密度可以直接了解肿瘤组织中的微淋巴管和微血管新生的活跃程度[7-8]。D2-40是一种淋巴管内皮特异性较高的淋巴管标记物，并且较HE染色方法能更敏感和特异地检测出肿瘤的微淋巴管浸润[9]。CD34是表达于正常内皮细胞表面的跨膜糖蛋白，是常用的血管内皮细胞标记物，其特异性及敏感性均高于CD31、V III因子的血管内皮细胞标志物，能特异性显示肿瘤的新生微血管，现已成为研究微血管的成熟标志物[10]。本研究通过D2-40、CD34标记乳腺癌患者肿瘤组织中的微淋巴管和微血管，该方法具有成熟、准确可靠等优点。

本研究结果显示，病例组患者乳腺癌组织D2-40蛋白表达水平和CD34蛋白表达水平明显高于对照组（P＜0.05），说明乳腺癌组织中微淋巴管密度、微血管密度高于乳腺增生组织，提示微淋巴管和微血管在乳腺癌组织发生、发展中发挥了重要作用，研究结果与文献报道[11-12]相一致。主要原因分析：乳腺癌组织分泌一些刺激血管及淋巴管生长的因子，刺激乳腺癌组织的微血管和微淋巴管生成，以满足乳腺癌组织的营养供给，促进乳腺癌组织的生长。魏晓龙等[13]研究报道，乳腺癌患者微血管密度与乳腺癌的大小和淋巴结转移成正相关，而与乳腺癌患者年龄、组织学分级等无关。沈叶等[14]研究报道，乳腺癌患者微血管密度与乳腺癌TNM分期、淋巴结转移、肿瘤分化程度、侵袭力等有关。本研究结果显示，微淋巴管密度和微血管密度与乳腺癌患者年龄无关（P＞0.05），与乳腺癌患者肿瘤直径、临床分期、淋巴结转移有关（P＜0.05），与上述文献报道相一致，进一步证实了微淋巴管密度和微血管密度与乳腺癌发生、发展的关系。主要原因分析：肿瘤能迅速生长取决于肿瘤组织血管、淋巴管的营养供应，肿瘤直径大，癌组织需要的营养供应多，刺激了微淋巴管密度和微血管密度增高，以满足营养的运输。不同的临床分期说明了肿瘤的恶性程度，恶性程度越高说明肿瘤组织生长越活跃，需要营养供应越多，在各种因子刺激下微淋巴管和微血管形成更多。癌细胞主要通过淋巴管发生转移，癌组织发生转移，说明癌组织生长迅速，需要更多的淋巴管和血管参与。微淋巴管密度和微血管密度与预后生存期无关，可能是乳腺癌患者生存期随着诊疗技术水平的提高已有显著提高，在较短的随访时间内，高低密度组患者生存可能无显著差异[15-16]，应继续延长随访时间。

综上所述，微淋巴管密度和微血管密度与与乳腺癌患者肿瘤直径、临床分期、淋巴结转移密切相关，与预后无明显相关性。研究乳腺癌组织血管及淋巴管生成，有助于了解乳腺癌发生、发展和转移机制，为以乳腺癌血管或淋巴管作为靶点的抗乳腺癌治疗提供理论基础，通过抑制和阻断血管及淋巴管生成途径，控制乳腺癌转移复发。

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（本文编辑：赵翠翠）

Relationship between microvascular density, micro lymphatic vessel density and clinicopathological char-acteristics of breast cancer

LYU Kejun. Department of Pathology, the First People’s Hospital of Yongkang,

Jinhua, 321300

Objective: To detect the expressions of microvascular density (MVD) and micro lymphatic vessel density (LVD) in breast cancer tissues, investgate the relationship between MVD, LVD and clinical pathological features of breast cancer. Methods: A total of 60 cases of breast cancer patients were selected as the patients group, and 60 cases of proliferative diseases of mammary gland patients were selected as the control group. By adopting D2-40 marker of lymphatic endothelial cells and CD34 marker of vascular endothelial cells, breast cancer MVD and LVD were counted separately under a microscope. The relationship between expressions of MVD, LVD and clinical pathological features also were analyzed the relationship between expressions of MVD, LVD of breast cancer patients. Results: In the patients group, the average value of LVD was (5.32±3.81), and the average MVD was (65.34±24.18). The protein expression level of D2-40 and CD34 in the patients group was signi fi cantly higher than that of the control group (P＜0.05), there is no correction of patients’ age with LVD and MVD (P＞0.05), there was correction of tumor size, clinical stage, lymph node metastasis with LVD and MVD (P＜0.05), and MVD and LVD were positively correlated (r=0.684, P＜0.05). There was no signi fi cant difference in survival time between higher LVD group and lower LVD group, higher MVD group and lower MVD group (P＞0.05). Conclusion: LVD and MVD are closely related with tumor diameter, clinical stage and lymph node metastasis in breast cancer patients, and no signi fi cant correlation with prognosis, which was closely related to breast cancer recurrence and distant metastasis.

microvessel; micro lymphatic vessel; breast neoplasms; clinical pathological characteristics

R737.9

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.05.014

2016-07-20

吕可君（1977-），女，浙江永康人，主治医师。