甘蔗黄叶病毒基因型研究进展

张荣跃，王晓燕，单红丽，李文凤，黄应昆

（云南省农科院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远 661600）

甘蔗黄叶病又称甘蔗黄叶综合症（Sugarcane yellow leaf syndrome，SYLS），是一种严重危害甘蔗的疾病，于1990年在夏威夷首次被发现[1]。该病由甘蔗黄叶病毒（Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV）引起，2006年Abu Ahmad等首次对ScYLV进行了基因型的分型[2]，之后陆续有新的基因型被发现，到目前ScYLV可分为7种基因型。ScYLV基因型的研究是目前甘蔗黄叶病毒研究的热点，不同基因型的ScYLV具有地域分布的差异，对甘蔗的致病性也有不同，因此，了解ScYLV的基因型对甘蔗黄叶病的诊断、防治和抗病育种具有重要意义。本文将对ScYLV的基因组结构、基因型的确立和发展、基因型的流行学分布、基因型分型方法和基因型与病害等方面的研究进展进行简单的阐述。

1 甘蔗黄叶病毒的基因组结构

甘蔗黄叶病毒（Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV）为正单链RNA病毒，全基因组由5895～5899个核苷酸组成。病毒基因组编码至少6个开放读码框（ORFs 0-5）和3个非编码区UTR，为典型的黄症病毒科的基因组。其它黄症病毒科病毒的研究结果表明，ORF0编码的蛋白可能与症状表达相关，最近研究表明ORF0还可能编码病毒的一个RNA沉默抑制子[3]。ORF1和ORF2一起翻译分别编码一个多功能肽和RNA依赖的RNA聚合酶。ORF1编码的多肽序列包括一种丝氨酸蛋白酶和病毒基因组结合蛋白（VPg）。ORF3和ORF4分别编码外壳蛋白和移动蛋白，ORF5不单独表达，而是通过核糖体通读机制与ORF3形成通读蛋白，与蚜虫传播病毒有关[4]。ORF1、ORF2与马铃薯卷叶病毒属 （Polerovirus）非常相似，ORF3、ORF4与黄症病毒属（Luterovirus）非常相似，而ORF5与耳突花叶病毒属（Enamovirus）非常相似，核苷酸序列对比表明ScYLV基因组在进化过程中至少发生了两次独立的重组，ScYLV被认为是一个由黄症病毒科3个不同属 （大麦黄矮病毒属、马铃薯卷叶病毒属和耳突花叶病毒属）的病毒重组后形成的病毒[5－6]。

2 基因型的确立和发展

2006年Abu Ahmad等通过对ScYLV基因序列的比较分析，建议将ScYLV分为3种不同的基因型，并以样品来源地进行了命名，即 BRA 基因型（Brazil），PER 基因型（peru）和 REU 基因型（Réunion Island）。 另外，古巴的一个分离物的ORF1核苷酸部分序列只有77%～80%与BRA基因型、PER基因型和REU基因型相同，这表明古巴的这个分离物代表了另外的一个基因型，即CUB基因型，或者甚至可以归为一个新的病毒种类[2]。然而，在这4种基因型中，BRA基因型和PER基因型非常接近，不能用特异性引物把它们区分开，因此Abu Ahmad等把这两个基因型合并为BRA-PER基因型进行研究[7]。2008年Viswanathan等从印度分离到的一个病毒的基因序列与已知的基因类型比较差异很大，部分ORF1和ORF2核苷酸序列与已报道的4种基因型相似性只有75.9%～88.0%，并提出这个分离物可以代表一个新的基因型，即IND基因型[8]。2010年Wang等对中国分离到的一个病毒进行测序，序列比较和系统进化分析结果表明这个分离物代表了一个新的基因型，并命名为CHN1基因型[9]。2011年ElSayed等分离到的夏威夷株系与PER基因亲缘关系较近，而与BRA和REU比较远，他们建议考虑夏威夷ScYLV为一个独立的组，与PER基因型一起为HAW-PER基因型[10]。近几年来，对ScYLV基因型的研究增多，目前已知的ScYLV有以上提到的7种基因型，但随着ScYLV基因型研究的开展，新的基因型可能会逐渐被发现。

3 基因型的流行学分布

2006年Abu Ahmad等利用3种不同基因型的特异性引物对采自18个国家或地区的245份甘蔗黄叶病样品进行了基因型鉴定，结果表明BRA-PER基因型在这18个地区都被检测到，CUB基因型在巴西、哥伦比亚、古巴、瓜德罗普岛的样品中被发现，REU基因型存在于巴西、瓜德罗普岛、毛里求斯和留尼汪岛的样品中[7]。2008年Viswanathan等对印度ScYLV的序列研究表明印度ScYLV基因组与世界上已知的ScYLV基因型有很大差异，进一步比较ORF1和ORF2的序列表明印度的甘蔗黄叶病至少由3种基因型引起，CUB，IND和BRA-PER，其中以CUB基因型为主，其次为IND和BRA-PER基因型[8]。2010年Joomun使用不同基因型的特异性引物对毛里求斯黄叶病样品进行RT-PCR检测，表明毛里求斯甘蔗黄叶病毒包含3种基因型，即BRA-PER基因型、CUB基因型和REU基因型[11]。2011年Singh等采集了印度6个甘蔗种植州的13个黄叶病样品，比较了病毒外壳蛋白序列，表明所有印度ScYLV分离物可聚为两个主要的组，这表明ScYLV两个株系影响印度甘蔗。然而，所有13个分离物被发现与古巴分离物相关，属于CUB基因型，得到印度甘蔗黄叶病是由CUB和IND两种基因型引起，而不是先前认为的3种基因型[12]。在我国，2012年Wang等对我国6个省份采集的129份甘蔗黄叶病样品进行RT-PCR-RFLP分析和序列测定，结果表明广东省采集的63个样品中包含5种基因型，分别为BRA，CHN1，CUB，PER和CHN2，其中43个样品为BRA基因型，占所有样品的68.3%，其它省份的66个样品均为BRA基因型[13]。2012年Gao等根据研究结果推测在中国至少存在4种基因型，即BRA、PER、CHN1和CUB[14]。以上研究结果表明，ScYLV基因型的分布有一定的区域性，BRA-PER基因型为主要基因型，在全世界均有分布，CUB基因型和REU基因主要分布于古巴和南美洲一些地方，而IND基因型、CHN基因型和HAW基因型仅分别分布于印度、中国和夏威夷。

4 基因型分型方法

目前ScYLV基因型的分型研究中主要使用以下3种方法：（1）ScYLV基因组测序，根据ScYLV核苷酸序列差异进行分型。该方法直接、可靠，但繁琐、费时、费用高，不适宜广泛开展；（2）反转录聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（RT-PCR-RFLP），以RT-PCR扩增ScYLV，再以一组能区分ScYLV基因型的限制性内切酶消化扩增产物，电泳后，根据酶切图谱进行分型。与其他分型方法相比，RFLP是目前常用的ScYLV分型方法，其方法简单且易于操作，但步骤较繁杂、易受污染、酶切位点易受基因变异的影响导致分型错误甚至无法确定。（3）特异性引物PCR，根据不同基因型ScYLV的特点，设计特异性引物进行PCR扩增，从而确定不同的基因型。该方法操作较简单准确，可用于ScYLV的分子诊断和大范围的调查。

5 基因型与病害

2003—2005年Abu Ahmad等对来自不同地区的自然感染了不同基因型ScYLV的两个甘蔗品种R570和SP71-6163进行了连续3年的发病情况观察，结果表明来自不同地区感染了不同基因型ScYLV的SP71-6163病害严重程度有差异，来自瓜德罗普岛的甘蔗病情严重程度总是高于来自巴西的甘蔗，这表明不同基因型的ScYLV之间存在致病性的差异。来自哥伦比亚感染了BRA-PER基因型的SP71-6163病害严重程度要高于来自巴西同样感染了BRA-PER基因型的SP71-6163，表明BRA-PER基因型之间也存在着致病性的差异。在大多数情况下，来自瓜德罗普岛同时感染了BRA-PER基因型和REU基因型的SP71-6163病害严重程度要高于来自巴西感染了BRA-PER基因型的SP71-6163，这表明BRA-PER基因型和REU基因型联合侵染对甘蔗更为致病[15]。2007年Abu Ahmad等在具有不同抗性的健康甘蔗上接种不同基因型的ScYLV，结果表明BRA-PER基因型和REU基因型对甘蔗的侵染能力和毒力有差异，在瓜德罗普岛和留尼汪岛，BRA-PER基因型比REU基因型更具侵染性，这也从另外一个方面证明了BRA-PER基因型和REU基因型为两个不同的病毒株系。然而，来自瓜德罗普岛的REU基因型ScYLV可以侵染甘蔗品种R570，但是来自留尼汪岛的REU基因型ScYLV却不能侵染，这也表明了在REU基因型之间也存在致病性的差异[16]。目前对于基因型与病害的研究较少，只有针对BRA-PER基因型和REU基因型的少量研究，不同基因型ScYLV对于甘蔗的致病性差异还需进一步深入研究。

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