大黄芒硝散外敷治疗大鼠阑尾周围脓肿的实验研究

沈建良+++潘良明++孔祥东++吴鸣+++袁绍峰

[摘要] 目的 探討大黄芒硝散对阑尾周围脓肿的干预效果，评估其临床应用价值。方法 选择SD大鼠（n=36）随机分为假手术组、给药组、对照组，每组12只，其中给药组和对照组通过盲肠结扎穿孔术制备阑尾周围脓肿模型，假手术组仅开腹翻动盲肠。给药组在右下腹涂抹大黄芒硝散5 g治疗，隔天给药；对照组涂抹凡士林，假手术组术后不予处理。对动物的体温、体重和白细胞数量等进行观察，检测血浆中炎症因子白介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。对病区组织标本HE染色大体评估各组局部组织炎症反应的强度和变化趋势，通过免疫组化和TUNEL实验进一步检测组织中炎症因子的分泌量及组织发生凋亡的程度。结果 各组动物的体温及体重之间差别无统计学差异（P > 0.05）；白细胞数量和TNF-α水平均是以对照组升高最明显，其次为给药组（P < 0.05）；而IL-1β在各组动物的变化不显著（P > 0.05）；HE染色、免疫组化及TUNEL实验结果显示对照组出现小肠壁增厚，炎症细胞浸润和TNF-α分泌量增加以及组织凋亡水平增强的表现，而应用大黄芒硝散干预后，上述表现均得到一定缓解。结论 大黄芒硝散用于阑尾周围脓肿的治疗可在一定程度上缓解炎症、消除肿胀，具有较好的临床应用价值。

[关键词] 大黄芒硝散；阑尾周围脓肿；炎症反应；组织凋亡

[中图分类号]R965 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（c）-0151-04

[Abstract] Objective To explore the intervention effect of rhubarb-mirabilite ointment on periappendiceal abscess and evaluate its clinical application value. Methods SD （Sprague Dawley） rats （n=36）were randomly divided into 3 groups： sham operation group， drug group and control group. The drug group and the control group were employed to periappendiceal abscess animal model by cecal ligation and puncture （CLP），while animals in sham operation group were only turned the cecum without CLP. The drug group were treated with rhubarb-mirabilite ointment （5 g） on the right ventral surface of the skin. The control group were treated with vaseline using the same method of delivery. While the sham operation group would not be treated after surgery. Firstly， the general indicators， such as body temperature， wight and white blood cells， were observed. And then the inflammation cytokine IL-1β and TNF-α was detected by ELISA. Further， local samples were collected in which the degree and variation trend of inflammation reaction was observed through the HE staining. And then immunohistochemical staining and TUNEL assay were also carried out to examine the secretion level of TNF-α and the degree of apoptosis in the local tissues of different groups. Results Body temperature and the weight of animals showed no significant change among different groups（P > 0.05）. It was showed that the levels of white blood cells and TNF-α were the highest in the control group， while rhubarb-mirabilite could appropriately block the rise of these two indicators （P < 0.05）. Besides， IL-1β didn't have obvious changes in each group （P > 0.05）. Further， the results of HE staining， immunohistochemical staining and TUNEL assay indicated that significantly thickened small intestinal wall， increased inflammatory cells infiltration and TNF-α secretion and enhanced apoptosis level were observed in control group， however， these indicators could be effectively relieved in rhubarb-mirabilite ointment treated group. Conclusion rhubarb-mirabilite ointment possessed a certain effect of easing inflammation and relieving swelling in periappendiceal abscess. It has good clinical application value.

[Key words] Rhubarb-mirabilite ointment； Periappendiceal abscess； Inflammation reaction； Apoptosis

急性阑尾炎是最常见的急腹症，其在人的一生中的发病风险为7%～8%[1]。所有急性阑尾炎的患者中有7%的人会形成阑尾周围脓肿[2]。阑尾周围脓肿的形成对手术切除阑尾造成一定的困难，可能增加手术并发症[3]，因此，阑尾周围脓肿的保守治疗已被外科专家所认可[4]。

西医保守治疗主要选用抗生素治疗，但当脓肿壁形成后，即使有较高的血药浓度，对脓肿内的细菌作用也较为有限[5]，因此辅以中药散剂局部外敷能进一步改善阑尾脓肿的预后[6]。现代临床经验证实大黄芒硝散外敷具有消炎止痛， 预防感染， 促进脓肿吸收等功效，在缓解腹痛腹胀、防治腹腔炎性包块及假性囊肿形成等方面具有一定疗效[7]。因此，本研究以中医学理论为指导，采用经典的盲肠结扎穿孔术制备阑尾周围脓肿模型[8]，并以大黄芒硝散行局部外敷治疗，检测其对阑尾周围脓肿的治疗效果，为中西医结合治疗阑尾周围脓肿提供有力的实验证据。

1 材料与方法

1.1动物

选用4月龄SPF级SD大鼠36只，购自西普尔-必凯公司，合格证号：SCXK（沪）2013-0016，体重（220±30）g，实验鼠术前适应性喂养1周，喂养条件：温度在18～26℃，相对湿度40%～70%，噪音85 dB以下，氨浓度20×10-6以下.通风换气8～12次/h。术前12 h禁食不禁水，实验时称重。本动物实验经动物伦理委员会的批准备案。

1.2仪器和试剂

DY20K电子天平（上海丙林电子科技有限公司）；DT-8806H 红外电子体温计（深圳华盛昌机械实业有限公司）；全自动血液分析仪（日本SYSMEX公司）；Universal32R Hettich低温高速離心机（德国Hettich科学仪器公司）； Leica DM 4000B光镜显微镜（德国莱卡公司）； OLYMPUS BX53倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）； TNF-α和IL-1βELISA试剂盒（上海鑫乐生物科技有限公司）； TNF-α一抗（美国abcam公司）；TNF-α二抗，DAB（福建迈新公司）；TUNEL试剂盒（瑞士罗氏公司）。

1.3 动物造模

盲肠结扎穿孔术制成阑尾周围脓肿大鼠模型参考相关文献[8]。具体方法为将大鼠盲肠根部结扎，用18号针穿通3次，挤出少量肠内容物，固定于周围小肠造成包裹，术后3 d内腹部触及包块或超声提示脓肿形成即为造模成功。假手术组只开腹、翻动肠道，但无盲肠结扎和穿孔，其余操作与模型组相同。

1.4 药物

取生大黄和芒硝各50 g，研磨后加入少量凡士林及适量开水制备成药膏，即用即配。

1.5 方法

动物编号后采用随机数字表法随机分为三组（n=12）：A组为假手术组，术后正常饲养，不予干预措施；B组为给药组，术后在大鼠右下腹涂抹大黄芒硝散，每只用量约5 g，隔天1次；C组为对照组，术后在大鼠右下腹凡士林，隔天1次。

1.6 观察指标

术后3、6、9 d对各组大鼠的体重和体温进行监测。处死动物后，对血液中的白细胞数量等进行观察，并检测血浆中炎症因子白介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。通过对病区组织标本HE染色大体评估各组局部组织炎症反应的强度和变化趋势，而后通过免疫组化和TUNEL实验进一步检测组织中炎症因子的分泌量及组织发生凋亡的程度。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计学处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，三组间各时间点比较采用单因素方差分析，组间两两比较，最小显著性差异法检测，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体温和体重

各组动物体温未出现明显的波动变化，平均体温维持37.5℃左右（图1A）。对照组和给药组相较假手术组体重增长速度慢，但整体差异无统计学意义（P > 0.05）（图1B）。

2.2 血液白细胞数量

术后3 d，对照组白细胞数量略升高，给药组白细胞数量未发生变化；至术后6 d，可见对照组和给药组白细胞数量明显增高，且对照组程度更高，但对比无显著性差异（P > 0.05）；至术后9 d时，给药组白细胞数量基本维持在术后6 d的水平，而对照组白细胞数量进一步增高，并与给药组和假手术组之间差异有高度统计学意义（P < 0.01）（图2）。

2.3 血浆炎症因子IL-1β和TNF-α水平

造模后IL-1β在各组动物各时间点的变化不显著（图3A，P > 0.05）；而TNF-α在不同组则出现不同的变化趋势，表现为：①假手术组在术后3 d时呈现TNF-α的轻度升高，而至术后6 d和9 d时则回落至一个较低且稳定的水平；②对照组中TNF-α则一直维持在较高的水平，且均高于假手术组；③虽然给药组TNF-α的水平也有升高，但程度在各时间点均低于对照组，含量较为恒定且有回落的趋势（图3B，P < 0.05或0.01）。

2.4 病区小肠的组织学观察

由HE染色结果（图4）可见，假手术组肠壁及小肠绒毛均未见明显的炎症反应；对照组肠壁及小肠绒毛在术后3 d时明显增厚，充满浸润的炎性细胞，炎性反应的表现随着时间延长逐渐加重；给药组在术后3 d时表现与对照组类似，但其浸润的炎性细胞少于对照组，且随着时间的延长，到手术6 d和9 d时可见增厚的肠壁及小肠绒毛逐渐变薄，炎症细胞逐渐消退，炎症反应出现了一定程度的缓解。

2.5 小肠组织TNF-α的免疫组化检测

通过免疫组化对术后6 d和9 d病区小肠组织内TNF-α的表达量进行了检测，结果显示假手术组组织内几乎无TNF-α的分泌，而对照组和给药组内均可见到TNF-α的阳性表达，且对照组明显高于给药组。见图5。

2.6 小肠组织的凋亡水平检测（TUNEL法）

小肠组织的凋亡水平检测（TUNEL法）结果可见假手术组6 d和9 d时组织内荧光强度较弱，发生凋亡的细胞较少；而对照组和给药组的肠壁和小肠绒毛内则可见大量阳性表现的细胞（绿色点状荧光，注：黑白印刷中为白色点状），且对照组明显多于给药组。见图6。

3讨论

关于阑尾周围脓肿的治疗是先行抗生素保守治疗再行手术干预[9-10]还是发病后立行手术干预[11-12]一直存在争议。为此，有学者在由穿孔导致的阑尾周围脓肿中对两种方案进行对比，认为这类患者先予保守治疗，而后再行阑尾切除，预后更好，其分析原因为：降低并发症的发生，缩短手术时间，降低患者住院时间[9-10]。因此认为，术前的抗生素干预是治疗阑尾周围脓肿的关键，但是如果脓肿壁形成，抗生素无法充分发挥作用，而导致相关症状无法有效缓解[13]。

中医认为：肠痈（阑尾周围脓肿）是因饮食不节，损伤脾胃，湿热内蕴；或饱食后急剧奔走，肠道运化失司等原因“酝而成脓”[14]。在演变过程中，正邪相争决定着热毒的局限与扩展、吸收与蔓延。大黄芒硝散中大黄有活血祛瘀、消热解毒、消肿止痛等功效，现代研究证实其具有促进肠道蠕动、加速肠道细菌和内毒素的排出、广谱抗菌及抑制过氧化损伤的作用[15]；而芒硝主要含含水硫酸钠（Na2SO4·10H2O）具有消除肠痈肿痛、腹满胀痛等作用。

为了探寻有效的阑尾周围脓肿干预措施，在本研究中将大黄芒硝散局部外敷于造模区域，通过体内试验对其效果进行评估。体温和体重监测中，各组动物的体温均保持稳定，这可能与大鼠良好的体温调节能力有关，造模组部分动物体重在术后6、9 d出现较明显的下降，则可能是由肠道粘连，蠕动功能障碍而引起食欲下降导致。通过对白细胞、IL-1β和TNF-α水平的分析发现，大黄芒硝散外敷虽然不能消除全身炎症反应，但对其具有一定缓解作用。通过组织标本的局部检测分析，观察到类似的表现，具体为：相较对照组而言，大黄芒硝散干预后可有助于缓解小肠壁和小肠絨毛的炎性反应，如可使肿胀的肠壁变薄、浸润的炎症细胞减少以及TNF-α分泌水平的下降等。由于造模方式的原因，发生组织凋亡不可避免，而在TUNEL实验的结果进行分析时发现给药组发生组织凋亡的程度低于对照组，这说明大黄芒硝具有一定延缓缺血缺氧肠壁组织凋亡的作用。

综上所述，大黄芒硝散虽然不能完全消除阑尾周围脓肿的肿胀和炎症，但可在一定程度上缓解上述症状，若将其与抗生素联用，可弥补抗生素治疗的不足，进一步改善阑尾周围脓肿的预后，具有很好的临床应用价值。

[参考文献]

[1] Stewart B， Khanduri P， McCord C， et al. Global disease burden of conditions requiring emergency surgery[J]. Br J Surg，2014，101（1）：e9-22.

[2] Andersson RE，Petzold MG.Nonsurgical treatment of appendiceal abscess or phlegmon：a systematic review and meta-analysis[J].Ann Surg，2007，246（246）：741-748.

[3] 唐雄荣，于庆生，王景祥.中西结合治疗阑尾脓肿远期随访[J].中国中西结合外科杂志，1995，2（2）：93-95.

[4] 刘金刚，余云.阑尾脓肿 508例诊治分析[J].中国实用外科杂志，1994，14（5）：291-293.

[5] 汪志平，徐良志.彩超引导下穿刺引流加抗生素灌洗保留术治疗阑尾周围脓肿83例[J].临床军医杂志，2013，41（3）：249.

[6] 罗淑红，谢雪华.中药外敷治疗阑尾周围脓肿61例[J]. 中医外治杂志，2013，22（4）：38.

[7] 徐雪芬，朱燕萍，潘芬华，等.大黄芒硝外敷结合中药灌肠治疗盆腔炎性包块疗效观察[J].浙江中医药大学学报，2010，34（2）：247-248.

[8] 黄鑫，张敏州. 盲肠结扎穿孔术-脓毒症模型研究的金标准[J]. 医学综述，2015，21（3）：392-395.

[9] Ein SH，Langer JC，Daneman A. Nonoperative management of pediatric ruptured appendix with inflammatory mass or abscess： presence of an appendicolith predicts recurrent appendicitis[J]. J Pediatr Surg，2005，40（0）：1612-1615.

[10] Zhang HL，Bai YZ，Zhou X.Nonoperative management of appendiceal phlegmon or abscess with an appendicolith in children[J]. J Gastrointest Surg，2013，17（4）：766-770.

[11] Puapong D，Lee SL，Haigh PI. Routine interval appendectomy in children is not indicated[J]. J Pediatr Surg，2007，42（9）：1500-1503.

[12] 张建辉.保守治疗和早期手术干预在阑尾周围脓肿的临床效果对比分析[J].中国卫生标准管理，2016，7（6）：61-62.

[13] Guida E，Pederiva F，Grazia MD，et al. Perforated appendix with abscess： Immediate or interval appendectomy？ Some examples to explain our choice[J]. Int J Surg Case Rep，2015，40（12）：15-18.

[14] 王振，王润春，刘桂荣. 张志远辨证论治消化系统疾病[J]. 实用中医内科杂志，2016，30（8）：6-7.

[15] 吕宾.中医药在重度急性胰腺炎治疗中的应用[J]. 中华消化杂志，2013，33（11）：743-745.

（收稿日期：2017-01-12 本文编辑：王 丽）