稳心颗粒对大鼠心肌肥厚及Connexin43表达的影响

龙俊蓉++邓彪++刘盛权++唐芬++谭文婷++刘茂军++杨军++褚春

[摘要] 目的 观察稳心颗粒对压力超负荷大鼠心肌肥厚和QT离散度以及缝隙连接蛋白43（Cx43）表达的影响。 方法 取45只雄性SD大鼠，以完全随机法分为正常组（N组）、心肌肥厚组（H组）、穩心颗粒组（W组）。采用腹主动脉缩窄法构建心肌肥厚大鼠模型，给予稳心颗粒6.25 g/（kg·d）治疗12周后，行超声心动图检测，并测定大鼠QT离散度，处死大鼠后以HE染色观察心肌病理形态变化，免疫组化法检测左室心肌Cx43蛋白的表达及分布，逆转录-链式聚合酶法检测心肌细胞Cx43 mRNA的表达。 结果 创建了压力超负荷诱导的心肌肥厚大鼠模型，超声心动图检测显示，与N组比较，H组大鼠出现明显心肌肥厚；W组和H组比较，以上参数有所改善。此外，H组的QT离散度比N组明显增加，而经稳心颗粒干预后的W组QT离散度较H组降低。同时，与N组大鼠比较，H组可见心肌细胞肥大、排列紊乱，且左室心肌组织Cx43的蛋白和mRNA表达明显减少；而W组和H组比较，心肌细胞排列紊乱则有所改善，Cx43的蛋白和mRNA的表达亦明显上调。 结论 稳心颗粒可改善压力超负荷大鼠的心肌肥厚，并降低QT离散度和改善心肌Cx43的重构。

[关键词] 稳心颗粒；心肌肥厚；Cx43；QT离散度

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（a）-0008-04

[Abstract] Objective To observe the effects of Wenxin Granules on cardiac hypertrophy and QT dispersion and the expression of connexin43 （Cx43） in pressure-overloaded rats. Methods Forty-five male Sprague-Dawley rats were divided into normal group （group N）， hypertrophy group （group H） and Wenxin Granules group （group W） by completely randomized method. The rat model of cardiac hypertrophy was established by constriction of abdominal aorta. When treated with Wenxin Granules 6.25 g/（kg·d） for 12 weeks， these rats were detected by echocardiography and QT dispersion. The pathological morphology of ventricle tissue was observed by HE staining， the expression of Cx43 protein and Cx43 mRNA in left ventricle was respectively detected by immunohistochemistry and RT-PCR after rats were sacrificed. Results The rat model of cardiac hypertrophy induced by pressure overload was established. Compared with group N， the rats in group H had obvious hypertrophy. Compared with group H， the above parameters were improved in group W. In addition， the QT dispersion of group H was significantly higher than that of group N， and the QT dispersion of group W was lower than that of group H. Meanwhile， compared with group N， group H showed hypertrophy and disorder of cardiac muscle cell， and the expression of Cx43 protein and mRNA in left ventricle myocardium was significantly decreased； while the hypertrophy and disorder were improved in group W when compared with group H， Cx43 protein and mRNA expression was also significantly increased. Conclusion Wenxin Granules can improve cardiac hypertrophy in pressure-overloaded rats， decrease QT dispersion and improve the remodeling of Cx43 in myocardium.

[Key words] Wenxin Granules； Cardiac hypertrophy； Cx43； QT dispersion

心肌肥厚是心脏对于长期压力负荷过大或者容量负荷过大所产生的一种适应性反应[1]，从而发生细胞肥大、排列紊乱等一系列病理改变，其不仅可以引起多种离子通道重构，也可导致缝隙连接重构，从而诱发各种心律失常。心肌肥厚作为心衰进展、心梗、猝死等心血管事件发生的一个独立危险因素[2-3]，能够显著增加住院率和病死率，所涉及的机制就与其导致的心脏电生理重构有关，而缝隙连接重构又是电生理失稳态的关键[4]。缝隙连接与细胞间的化学交流和电冲动的传导密切相关[5]，有研究发现，心肌中主要有三种缝隙连接蛋白，其中Cx43在心室肌中表达最多，少量分布于心房肌。当发生心肌肥厚时，Cx43表达下调[6]，引起心肌细胞解偶联，这与心律失常的发生及进展息息相关。因此，以Cx43为靶点研发抗心律失常药物成为当今的一大热点。稳心颗粒对治疗房颤、多形性室速等心律失常具有相当理想的效果，可降低QT离散度（QTd）[7]，这可能与其选择性阻滞心房钠通道和抑制心室晚电位有关[8]，但其是否能对细胞间的连接蛋白重构起作用，目前尚缺乏相关研究。本研究旨在探讨稳心颗粒对肥厚心肌和Cx43表达的影响，了解其对肥大心肌细胞及缝隙连接重构的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

45只6周龄SPF级雄性SD大鼠（180～200 g），动物合格证号：SYXK（湘）2015-0001，购自南华大学动物实验中心，饲养于恒温（22±1℃）恒湿环境中，人工照明12 h，可自由获得水和食物。步长稳心颗粒（陕西步长制药公司，批号1505093）；免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、一抗Cx43（10D101）、羊抗兔二抗（150361）（武汉博士德公司）。

1.2 制备心肌肥厚模型

采用改良腹主动脉缩窄法[9]造模。以完全随机法将大鼠分成三组：正常组（N组），心肌肥厚组（H组），稳心颗粒组（W组）。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，剂量为每只3 mL/kg。取左侧卧位固定大鼠，以右肾的体表投影为中心做一2～3 cm的纵行切口后寻找右肾动脉，在腹主动脉发出右肾动脉分支点上方约2 mm处分离腹主动脉，H组和W组大鼠用4号缝线将直径0.8 mm的针头与腹主动脉一起结扎，随后抽出针头，还纳脏器，缝合切口。N组不结扎腹主动脉，余处理相同。W组给予溶解了稳心颗粒6.25 g/（kg·d）的生理盐水灌胃，N組和H组则予等量生理盐水。12周后测左室后壁及室间隔厚度，明显增加提示造模成功。

1.3 测量QTd

12周后，同法麻醉并固定大鼠，将刺激电极（张家口教学仪器厂）插入大鼠皮下，行常规12导心电图，Powlab 16导生理记录仪（澳大利亚埃得公司）输入信号，QTd即为最大QT间期（QTmax）与最小QT间期（QTmin）之差。

1.4 检测超声心动图

12周后，麻醉并固定大鼠，胸前区备皮。用超声探头（频率为13 MHz）置于左胸前，图像深度调整至2.0～2.5 cm，由心脏彩超医生测量左室后壁舒张末期厚度（LVPWd）、舒张末期室间隔厚度（IVSd）及左室舒张期内径（LVIDd）。

1.5 测定左室重量

称量大鼠体重（BW），麻醉开胸，取出心脏后用生理盐水洗净，保留左室和室间隔，滤纸吸干水分，称量左室重量（LVW），计算左室重量指数（LVM/BW）。

1.6 HE染色观察

取部分左室心肌于10%甲醛中固定，石蜡包埋、切片，按步骤行HE染色，最后树胶封片，在光镜下观察细胞形态。

1.7 检测心肌Cx43蛋白

取2～3 mm纵切左心室组织，按说明书行免疫组化染色，光镜下心肌中的深棕色颗粒即为Cx43。使用IPP 6.0软件测量染色区域的总光密度值和染色面积，两者比值为平均光密度值（OD值）。

1.8 检测细胞Cx43 mRNA

称取80 mg心肌，研磨成粉末后提取组织RNA，再按逆转录试剂盒（美国Fermentas公司）说明书将11.5 μL RNA逆转录成cDNA。参考Genebank资料设计并合成Cx43及β-actin的引物，在PCR仪（德国Biometra公司）中分别扩增两者序列长度至588 bp和400 bp。反应条件：94℃预变性2 min，再变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s并循环35次，最后72℃延伸5 min。取适量PCR产物，以1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察，AlphaImager软件扫描各DNA条带，测得灰度值后计算半定量灰度比值（IDV比值）。

1.9 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件。计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物存活、电生理及心脏超声结果

N组死亡4只，H组死亡5只，W组死亡6只，共30只大鼠完成实验。造模12周后，各组大鼠QTd结果显示：与其他两组比较，H组大鼠QTd显著增加（P < 0.05），而N组与W组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。大鼠LVW/BW结果显示：与N组比较，H组大鼠的LVM/BW增加明显（P < 0.05），而N组与W组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。各组大鼠心脏超声结果显示：与N组比较，H组大鼠心脏LVPWd、IVSd明显增加，LVIDd则明显减小；与H组比较，W组大鼠LVPWd、IVSd有所降低，LVIDd明显增加，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 HE染色结果

镜下观察大鼠心肌组织形态结构变化，结果显示与N组比较，H组心肌细胞排列紊乱，而用稳心颗粒干预的W组，心肌细胞排列则有所改善。见图1（封三）。

2.3 心肌Cx43蛋白表达的检测

免疫组化结果显示：左室心肌组织Cx43免疫标记阳性蛋白呈深棕色颗粒（箭头所示）。与N组比较，H组大鼠心肌组织Cx43蛋白表达下调，且排列紊乱。与H组比较，W组大鼠心肌组织Cx43表达增加。见图2（封三）。

2.4 心肌组织Cx43 mRNA表达的检测

实验大鼠心肌Cx43及β-actin的mRNA表达水平及电泳条带位置见图3。从图中可以看出，H组大鼠心肌组织Cx43mRNA的IDV比值较N组减小（P < 0.05）；而W组Cx43 mRNA的IDV比值较H组增大，提示稳心颗粒干预能上调压力超负荷下大鼠肥厚心肌组织Cx43 mRNA表达。

3 讨论

心肌肥厚是长期处于超负荷状态的心肌细胞在神经体液因素影响下发生肥大、间质增生等病理变化[10]，是心脏病变时的一个代偿机制，伴随着心肌重构进展到失代偿期，引起心肌收缩力减退，最终发生心力衰竭[11-12]。本研究为了探究稳心颗粒对心肌肥厚及Cx43的作用，通过腹主动脉缩窄法构建了心肌肥厚大鼠模型，超声心动图显示H组大鼠心脏LVPWd、IVSd明显增加，LVIDd则明显减小，提示心肌出现明显肥厚，且HE染色结果表明H组大鼠心肌细胞肥大，排列紊乱，进一步证明造模成功。

Cx43蛋白作为缝隙连接蛋白的一种，主要存在于心室肌。已有文献报道[13-14]，Cx43的分布和表达在心肌重构中有重要地位，因其正常的表达和分布是维持心脏正常电生理活动及协调舒缩功能的基础之一[15]，而心肌重构又可引起电生理紊乱及心脏舒缩功能受限。QTd是反映心室肌细胞复极不均一性和心电活动不稳定性的一项电学定量指标，因此测定QTd可以了解各组大鼠心电生理有无异常。本研究结果显示，心肌肥厚的大鼠QTd明显增加，表明心电活动受到影响。大鼠舒缩功能虽未明显受限，但心肌细胞已有肥大，延长干预时间或许就能出现。本研究免疫组化结果表明，H组大鼠心肌细胞Cx43蛋白表达减少，分布异常，电泳结果显示mRNA表达下降，提示心肌肥厚引起了Cx43的重构。研究表明，负荷诱导下的心肌肥厚可引起心肌细胞Cx43的表达下调[16-17]，这与本研究结果吻合。此外，有学者认为，Cx43在心肌缺血/再灌注损伤及心肌保护方面将是一个新的治疗靶点[18-19]，因此，研究出对改善Cx43重构的药物有很大的前景。

稳心颗粒以中医理念为基础，经反复筛选，最终由三七、党参、甘松、黄精、琥珀五味中药组成[7]，是疗效可观的抗心律失常中成药。有研究表明，稳心颗粒能在一定程度上降低不良神经内分泌因素对心血管的破坏性，本研究结果也提示了稳心颗粒干预12周后的大鼠心肌肥厚得到改善。朱艳霞等[20]研究显示，稳心颗粒可抑制膜离子通道作用及动作电位延长，改善心肌细胞超微结构的稳定性，进而改善心血管的电重构，本研究发现经稳心颗粒干预后，H组大鼠的QTd明显降低，进而改善了心肌复极时限延长。但其在对Cx43重构方面有无干预作用，尚无相关研究。本研究发现，稳心颗粒能够上调肥厚心肌细胞Cx43蛋白和mRNA的表达，改善Cx43的紊乱排列，提示稳心颗粒可能在一定程度上干预了缝隙连接蛋白的重构。

综上所述，稳心颗粒可以改善压力超负荷下的心肌肥厚，机制可能与其改善Cx43重构有关，但具体的信号调控机制仍需要进一步的研究。与此同时，稳心颗粒除能有效抗心律失常外，还有望成为改善心肌肥厚，抑制心肌重构、延缓心力衰竭进程的第一种中成药。

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（收稿日期：2017-01-02 本文编辑：张瑜杰）