瑶药扶芳藤对血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用

朱智德++罗宇东++蒋林++谭安蔷

[摘要] 目的 研究瑶药扶芳藤乙醇、正丁醇提取物对血管内皮细胞ECV-304缺氧损伤的作用影响。 方法 体外培养ECV-304细胞，MTT法测定扶芳藤提取物细胞毒性，以Na2S2O4诱导ECV-304细胞缺氧损伤模型，分别将扶芳藤乙醇、正丁醇提取物作用于细胞24 h后，MTT法检测细胞存活率；收集细胞上清液，检测LDH露出率；台盼蓝计数检测细胞死亡率。 结果 扶芳藤乙醇和正丁醇提取物浓度为25～400 μg/mL，对ECV-304细胞均无细胞毒作用；与模型对照组比较，扶芳藤乙醇（浓度50 μg/mL）、正丁醇（浓度50、100、200 μg/mL）提取物对缺氧损伤ECV-304细胞存活率有显著提高，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。与模型对照组比较，扶芳藤正丁醇提取物（浓度100 μg/mL）能明显降低缺氧损伤ECV-304细胞上清LDH露出率，（P < 0.05）；与模型对照组比较，扶芳藤正丁醇提取物（浓度50、100、200 μg/L）能抑制缺氧损伤细胞ECV-304凋亡（P < 0.01）。 结论 扶芳藤提取物对Na2S2O4诱导的血管内皮细胞缺氧损伤有一定保护作用。

[关键词] 扶芳藤；血管内皮细胞；缺氧损伤

[中图分类号] R28 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（a）-0026-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of ethanol and butanol extract of Yao medicine Euonymus fortunei on ECV-304 hypoxia injury of vascular endothelial cells. Methods ECV-304 cells were cultured in vitro， and the cytotoxicity of Euonymus fortunei extract was determined by MTT. ECV-304 cells hypoxia injury model was induced by Na2S2O4， respectively Euonymus fortunei ethanol and n-butanol extracts from cells after 24 h， the survival rate of cells was detected by MTT. The cell supernatant was collected for detection of LDH， the cell apoptosis rate was detected by trypan blue staining. Results Euonymus fortunei ethanol and n-butanol extract was in 25-400 μg/mL concentration range， which was no cytotoxic effect on ECV-304 cells. Compared with the model group， the ECV-304 cells survival rate of Euonymus fortunei （ethanol concentration of 50 μg/mL）， n-butanol （concentration of 50， 100， 200 μg/mL） extract on hypoxia injury was significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with the model group， the ECV-304 cells LDH exposed rate of Euonymus fortunei n-butanol extract （concentration of 100 μg/mL） was significantly decreased （P < 0.05）. Compared with the model group， the ECV-304 cells apoptosis rate of Euonymus fortunei n-butanol extract （concentration of 50， 100 and 200 μg/mL） was inhibited （P < 0.01）. Conclusion The extract of Euonymus fortunei has protective effect on Na2S2O4 induced hypoxia injury of vascular endothelial cells.

[Key words] Euonymus fortune； Vascular endothelial cells； Hypoxia Injury

血管內皮细胞是连续被覆在全身血管内膜的一层细胞群，其在血管生成、止血、创伤修复等病理和生理过程中起着重要作用，血管内皮细胞的损伤与多种心血管疾病（如动脉粥样硬化、高血压、血栓形成等）有密切的关系，从整体、细胞、分子水平研究对血管内皮细胞具有保护作用的药物，对心血管疾病的防治研究具有重要意义。现代研究表明，活血化瘀类中药及其有效成分能从多个方面保护血管内皮细胞免受损伤和促进内皮细胞增殖，从而为中药治疗血管内皮细胞功能受损相关性疾病提供了药理学依据[1-5]。

扶芳藤Euonymus fortunei （Turcz.） Hand.-Mazz.为卫矛科植物爬行卫矛的地上部分，广西瑶、壮族特色药材，其性微温，味甘、苦、微辛，具补肝肾、止血消瘀、舒筋活络功效，民间主要用于腰肌劳损、风湿痹痛、咯血、血崩、月经不调、跌打骨折、创伤出血等；现代药理研究表明，扶芳藤具有抗肿瘤、止血、免疫调节、保护脑组织和心血管等作用[6-16]；

本试验研究扶芳藤提取物对Na2S2O4诱导的血管内皮细胞损伤的作用影响，从血管内皮细胞保护角度探讨扶芳藤抗心血管病的作用机制，为扶芳藤及其中药复方的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

扶芳藤乙醇、正丁醇提取物的制备：扶芳藤药材（广西玉林同康药业有限公司，批号：20150601）1000 g切成粗段，置于中试型多能提取器中，加入50%乙醇回流提取2次，50%乙醇体积为第一次10 000 mL，第二次8000 mL，每次提取2 h，将提取液用滤纸抽滤，旋转蒸发仪回收乙醇，滤液浓缩成稠膏（相对密度约1.10），即得乙醇提取物，备用。

另取扶芳藤药材100 g，打成细粉，加4倍量的正丁醇（即400 mL）进行索氏提取，提取液用滤纸抽滤，旋转蒸发仪回收溶剂后减压干燥，得到扶芳藤正丁醇提取物，备用。

以上扶芳藤乙醇、正丁醇提取物浸膏，每克膏分别相当于25.5、779.4 g的药材量。由广西中医药大学制药厂提供。

1.2 试剂

RPMI1640培养基（gibco公司）；胎牛血清（HyClone）；胰蛋白酶（Solarbio）；双抗（gibco公司）；SOD试剂盒（批号：20150110，南京建成生物工程研究所）、NO试剂盒（批号：20150105，南京建成生物工程研究所）、NOS试剂盒（批号：20150110，南京建成生物工程研究所）；四氮唑蓝MTT（SIGMA）；H2O2（批号：141021，南国药业），Hochest染料（碧云天），乙醇（分析醇，批号：20151010R），正丁醇（分析醇，上海申博化工有限公司，批号：0607101）。

1.3 仪器

倒置显微镜（LEICA DMIRB）；二氧化碳培养箱（美国Thermo）；超净工作台（荷兰ClearAir公司）；离心机（德国Biofuge Stoctos 公司）；连续波长酶标仪（上海科华实验系统有限公司，ST360）；中试型多能提取器（武汉制药机械设备公司设备制造厂），旋转蒸发器（RE-52A，上海亚荣生化仪器厂），多能数显恒温水油汽锅（巩义市予华仪器有限公司），真空干燥箱（ZK-82A，上海市实验仪器总厂）。

1.4 药物配制

分别称取扶芳藤乙醇、正丁醇提取物浸膏0.1218、0.1330 g，溶解于1 mL DMSO溶液中，获得121.8、133 mg/mL母液，于4℃保存，正式试验以母液稀释成所需的浓度，控制DMSO的终浓度在0.05%以内。

1.5 细胞培养

血管內皮细胞ECV-304细胞株购于（广州吉妮欧生物科技有限公司），培养于含10%胎牛血清和双抗1%的RPMI1640培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中传代培养[17-19]。

1.6 观察指标

1.6.1 扶芳藤各提取部位对正常ECV-304细胞生长情况的影响 取对数生长期细胞，将细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100 μL，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。待细胞长满单层后，实验分为正常对照组、扶芳藤乙醇提取物5个浓度组、正丁醇提取物5个浓度组，5个浓度组终浓度为25、50、100、200、400 μg/mL，每组4个复孔。正常对照组加培养基，各药物组加相应终浓度的药物，继续在培养箱中培养24 h，用MTT法测定细胞存活率。

1.6.2 扶芳藤各提取部位对Na2S2O4诱导缺氧损伤ECV-304细胞生长情况的影响 取对数生长期细胞，将细胞以5000 个/孔的密度接种于96孔板中，每孔100 μL，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。待细胞长满单层后，实验分为正常对照组、模型对照组（Na2 S2O4终浓度为10 mmol/L）、扶芳藤乙醇、正丁醇提取物均设3个浓度组别（终浓度为50、100、200 μg/mL）。除正常对照组，其余各组均加终浓度为10 mmol/L Na2S2O4作用细胞1 h，造成细胞缺氧损伤，然后去掉上清液，PBS洗2次，模型对照组加入培养基，药物组加入相应浓度药物，继续培养24 h，用MTT法测定细胞存活率。

1.6.3 扶芳藤各提取部位对Na2S2O4诱导缺氧损伤ECV-304细胞上清LDH露出率的影响 细胞处理方法见“1.6.1”，待药物处理24 h后，收集上清液，按试剂盒说明测定细胞上清LDH含量。

1.6.4 台盼蓝染色法测定细胞死亡率 取对数生长期细胞，将细胞以20 000个/孔，的密度接种于24孔板中，用药处理后（方法同“1.6.1”），分别收集细胞悬液，用PBS洗2次，最后将细胞制成悬液，取细胞悬液9滴加0.4%台盼蓝溶液1滴混匀，3 min内，用血球计数板计数蓝染的死细胞和拒染的活细胞共20个，细胞死亡率（%）=死细胞数/总细胞数×100%。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扶芳藤各提取部位对正常ECV-304细胞生长情况的影响

扶芳藤乙醇、正丁醇提取物组在25～400 μg/mL浓度范围内对正常ECV-304细胞生长无影响，与正常对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 扶芳藤提取物对Na2S2O4诱导缺氧损伤ECV-304细胞生长情况的影响

从表2提示，模型对照组、扶芳藤乙醇提取物组（浓度为50、100、200 μg/mL）、扶芳藤正丁醇提取物组（浓度为50、100、200 μg/mL）OD值与正常对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），提示造模成功；而扶芳藤乙醇提取物组（浓度为50 μg/mL）、正丁醇（浓度为50、100、200 μg/mL）提取物组对缺氧损伤ECV-304细胞存活率有显著提高，OD值与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表2。

2.3 扶芳藤各提取部位对Na2S2O4诱导缺氧损伤ECV-304细胞上清LDH露出率的影响

模型对照组、扶芳藤乙醇提取物组（浓度为50、100、200 μg/mL）、扶芳藤正丁醇提取物组（浓度为50、100、200 μg/mL）LDH露出率与正常对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），提示造模成功；而扶芳藤正丁醇提取物组（100 μg/mL）能明显降低缺氧损伤ECV-304细胞上清LDH露出率，LDH露出率与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

2.4 扶芳藤提取物对ECV-304细胞缺氧损伤死亡率的影响

模型对照组、扶芳藤乙醇提取物组（浓度为50、100、200 μg/mL）、扶芳藤正丁醇提取物组（浓度为50、100、200 μg/mL）凋亡率与正常对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01），提示造模成功；扶芳藤正丁醇提取物组（浓度为50、100、200 μg/mL）能抑制缺氧损伤细胞ECV-304凋亡，凋亡率与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表4。

3 讨论

血管内皮功能缺失或受损是导致多种心血管疾病发生和发展的早期征兆，在血管新生、止血与血栓、辐射损伤、免疫及炎性反应等一系列重要的病理生理过程起着重要的作用。慢性缺氧是心脑血管疾病中常见的一个病理性刺激，首先作用于血管内皮细胞，引发内皮细胞异常分泌多种生物活性物质，进而引起内皮功能障碍，内皮细胞损伤在动脉粥样硬化发病机制中也有重要的始动作用。而心血管疾病是世界上发病率和凋亡率最高的疾病之一，所以对内皮功能和结构受损的研究并探求有效的干预措施，对心血管疾病的治疗学发展有非常重要的意义[1-5]。

卫矛属植物是一类重要的天然药用资源，在世界各地均有分布，在我国民间作为药物使用有着悠久的历史，主要用于抗肿瘤、抗炎、抗菌等[20]。扶芳藤为卫矛科植物扶芳藤Euonymus hederaceus Champ.Ex Benth的根、树皮或叶，为广西壮族、瑶族地区的民间常用药材，主要用于治疗肾虚腰痛、慢性腹泻、跌打损伤、月经不调等，临床应用广泛。国内对扶芳藤的药理研究已经取得了一定的成果，表明其具有抑菌、抗凝血、活血化瘀、抗炎、镇痛、抗疲劳、免疫增强等作用[6-10]。冠心病属于中医心痛、胸痹范畴，病位在心，病机多为本虚标实，临床论治多采用益气活血行气化痰、通阳开痹等方法。近年来，扶芳藤临床上多用于治疗心脑血管疾病，临床和动物实驗研究已经表明，扶芳藤对心脑血管缺血再灌注损伤具有保护作用，扶芳藤可通过清除氧自由基抑制了脂质体的氧化，抑制脑组织中IL-1β和TNF-α的含量从而对心肌缺血再灌注或急性脑缺血再灌注损伤起到了保护作用[11-13]。

扶芳藤主要含有卫矛醇、三萜类、黄酮类、木脂素、类倍半萜吡啶生物碱类、糖醇类等化学成分[8-10]；课题组前期对扶芳藤所含化学成分进行纯化检识及含量测定研究表明，扶芳藤50%乙醇提取物主要含生物碱、卫矛醇、黄酮等成分，扶芳藤正丁醇提取物则含三萜皂苷类成分。本文实验结果显示，扶芳藤乙醇、正丁醇提取物对正常ECV-304细胞生长无影响，各试药组OD值与正常对照组比较无显著差异，但乙醇提取物对ECV-304细胞存活率影响呈“钟罩型”的趋势，这或许与乙醇提取物中所含卫矛醇成分具有清除氧自由基抑制脂质体的氧化，从而促进正常ECV-304细胞的生长有关；扶芳藤乙醇、正丁醇提取物对缺氧损伤ECV-304细胞存活率有显著提高，提示扶芳藤乙醇或正丁醇提取物对Na2S2O4诱导的血管内皮细胞缺氧损伤均有一定的保护作用，这或许是其临床用于活血化瘀，治疗心血管疾病的机制之一。同时，本实验也发现，扶芳藤正丁醇提取物与乙醇提取物比较，在提高缺氧损伤ECV-304细胞存活率方面作用更为明显，且能明显降低缺氧损伤ECV-304细胞上清LDH露出率，并能抑制缺氧损伤细胞ECV-304凋亡，而乙醇提取物对缺氧损伤ECV-304细胞上清LDH露出率和凋亡均无影响，提示扶芳藤中三萜皂苷类成分或许为保护缺氧损伤血管内皮细胞的主要成分之一，而乙醇提取物中所含成分较多，多种物质的综合效应使之对缺氧损伤ECV-304细胞的存活率，上清LDH露出率和凋亡作用不显著。现代研究表明，血管内皮细胞能合成和分泌多种血管活性物质如NO、ET等，NO对血管有扩张作用，ET对血管有收缩作用，正常情况下二者保持动态平衡，NO的作用略占优势以保持血管壁的平滑和血流的通畅，内皮细胞受到损伤时，NO和ET之间的动态平衡受到破坏，NO生成量下降，ET 表达量增加导致微血管痉挛并阻塞血流[18-22]。另外，至少有30多种生长因子与的血管生成有关，而最直接的促血管生成因子是血管内皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，而细胞凋亡与其相关蛋白Bax、Bcl-2和caspase-3表达相关，扶芳藤提取物对血管内皮细胞缺氧损伤的保护使用是否为影响血管活性物质、生长因长的生成及凋亡蛋白的表达有关，还有待进一步的研究。

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（收稿日期：2016-11-22 本文编辑：李岳泽）