苦苣菜水提物抗急性炎症活性及其机制研究

2017-06-01王振苗董丽荣贾评田慧

中国医药导报 2017年10期

王振苗++董丽荣++贾评++田慧

[摘要] 目的分析苦苣菜水提物對机体炎症相关通路的调节作用，并进一步对作用机制进行研究。方法取雄性健康昆明种小鼠100只进行耳肿和足肿实验，按随机数字表法分为每组10例，分别为模型组、地塞米松（2 mg/kg）阳性药物组（阳性对照组）、苦苣菜水提物0.26 g/10 g剂量组（高剂量组）、苦苣菜水提物0.13 g/10 g剂量组（中剂量组）、苦苣菜水提物0.065 g/10 g剂量组（低剂量组）。检测不同组间血清及炎性组织液中环氧化酶（COX-2）、p38丝裂原活化蛋白酶（p38 MAPK）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白介素-6（IL-6）水平。结果不同剂量组间小鼠耳廓肿胀与足跖肿胀度均存在差异（P < 0.05）；与模型组相比，不同剂量组小鼠耳廓肿胀与足跖肿胀度均受到不同程度的抑制，且随着给药剂量的增大效果逐渐增强。阳性对照组、苦苣菜水提物中剂量与高剂量组组织液中COX-2、p38 MAPK、TNF-α、IL-6水平与模型组相比存在显著性差异（P < 0.05）。阳性对照组、苦苣菜水提物中剂量血清中的COX-2、p38 MAPK水平与模型组相比存在显著性差异（P < 0.05）；阳性对照组、苦苣菜水提物中剂量与高剂量组血清中的TNF-α、IL-6水平与模型组相比存在显著性差异（P < 0.05）。结论苦苣菜水提物的抗炎机制涉及到炎症发生过程中的多个环节和炎症因子，有望研发成为有效的抗炎新药，为防治炎症性疾病提供新的药用和食疗资源。

[关键词] COX-2；p38 MAPK；TNF-α；IL-6

[中图分类号] R961 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（a）-0031-04

[Abstract] Objective To analysis the regulation effect of water extract of Sonchus oleraceus on inflammation related pathways and further investigate the mechanism. Methods 100 healthy male Kunming mice were selected for ear swelling and foot swelling test， which were randomly divided into model group by random number table method： dexamethasone（2 mg/kg） positive drug group（positive control group）， the water extract of Sonchus oleraceus 0.26 g/10 g dose group （high dose group）， the water extract of Sonchus oleraceus 0.13 g/10 g dose group （middle dose group）， Sonchus oleraceus 0.065 g/10 g dose group （low dose group）， with 10 mice in each group. Cyclooxygenase （COX-2）， p38 mitogen activated protein kinase（p38 MAPK）， tumor necrosis factor alpha（TNF-α） and interleukin-6（IL-6） levels of serum and inflammatory tissue fluid were detected in the different groups. Results There were significant differences in ear swelling and paw swelling in mice between different dose groups（P < 0.05）； compared with the model group， ear swelling and paw swelling in the different dose groups were inhibited to varying degrees， and the effect was increased with the increase of dose. COX-2， p38 MAPK， TNF-α， IL-6 levels of tissue fluid in the positive control group， middle dose group and high dose group were significantly different （P < 0.05）， compared with the model group. COX-2 and p38 MAPK levels of serum in the positive control group， middle dose group were significantly different （P < 0.05）， compared with the model group. TNF-α and IL-6 levels of serum in the positive control group， middle dose group and high dose group were significantly different （P < 0.05）， compared with the model group. Conclusion The anti-inflammatory mechanism of water extract of Sonchus oleraceus involves several aspects and inflammatory factors in the process of inflammation， it is expected to be developed into new anti-inflammatory effective drugs， to provide new medicinal and therapeutic resources for the prevention and treatment of inflammatory diseases.

[Key words] COX-2； p38 MAPK； TNF-α； IL-6

苦苣菜（Sonchus oleraceus L.）又名苦菜、滇苦菜、苦荬菜等，属菊科，苦苣菜属。苦苣菜属植物的主要活性成分是倍半萜类和黄酮类，此外，还有香豆素类、甘油酸酯苷类、木脂素类等。苦苣菜及提取物具有降血糖、降压、降脂、利尿、保肝、抗肿瘤等多种药理作用[1]。近年来，动物实验发现苦苣菜属植物可明显抑制动物耳肿、足肿，并能抑制腹腔毛细血管通透性的增加，证明其具有抗菌、抗炎作用[2]。在临床也常与其他中药配伍用于治疗肠胃炎、肺热咳嗽、咽喉肿痛等多种炎症性疾病。抗炎机制涉及到抗氧化、减少一氧化氮（NO）生成、抑制凋亡等多方面内容，机制复杂，因此目前尚缺乏系统的阐明[3]。本课题旨在通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀和角叉菜胶诱导小鼠后足跖肿胀建立急性炎症模型，研究苦苣菜水提物对多种急性炎症的拮抗作用，并通过检测小鼠炎性组织液和血清中环氧化酶-2（COX-2）、p38 丝裂原活化蛋白酶（p38 MAPK）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等多种炎症相关因子的含量变化，进一步探讨苦苣菜水提物对这些细胞因子、炎性介质的影响，对机体炎症相关通路的调节作用，初步分析苦苣菜水提物抗炎免疫活性的有关机制，为防治炎症性疾病提供新的思路。

1仪器与材料

1.1主要仪器

Sigma4-15高速冷冻离心机（德国Sigma公司），Tecan Safire2酶标仪（意大利Tecan公司），LE225D电子天平（德国Sartorius公司），RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），电热恒温水浴锅（北京精科华瑞仪器有限公司）等。

1.2主要试药

二甲苯分析纯（天津市永大化学试剂有限公司，批号20110707），角叉菜胶（德国Sigma公司，批号127H1227），COX-2酶联免疫吸附测定法（Enzyme- Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）试剂盒、p38 MAPK（ELISA）试剂盒、TNF-α（ELISA）试剂盒、IL-6（ELISA）试剂盒（北京冬歌生物科技有限公司）。苦苣菜采自内蒙古土默特左旗田间，经内蒙古医科大学生药学教研室青梅、庞秀生教授鉴定。

1.3 实验动物

雄性健康昆明种小鼠100只，体重20～22 g，2～3月龄，由中国食品药品检定研究院提供，均为无特殊病原体动物（SPF），合格证号：SCXK（京）2014-0013。饲养于室温（23.0±2.0）℃、湿度40%动物室内，自由摄食，饮水，1周后用于实验，至实验时体重为30～35 g。该研究经动物医学伦理委员会批准通过。

1.4苦苣菜水提物的制备

取苦苣菜全草，阴干，剪碎，称取原生药130 g，加适量水浸泡30 min，按照1∶10固液比加水，煎煮60 min，收集滤液Ⅰ，滤渣加适量水煎煮45 min，得滤液Ⅱ，合并滤液Ⅰ、Ⅱ，经减压浓缩，得1.3 g/mL浓缩液100 mL，冷却，置于4℃冰箱中备用。

1.5 分组与给药

采用随机数字表法将小鼠随机分成10组（n=10），5组进行耳肿实验，5组进行足肿实验。两组实验中均根据用药不同设置模型组、地塞米松（2 mg/kg）阳性药物组（阳性对照组）、苦苣菜水提物0.26 g/10 g剂量组（高剂量组）、苦苣菜水提物0.13 g/10 g剂量组（中剂量组）和苦苣菜水提物0.065 g/10 g剂量组（低剂量组）。各组均采用灌胃（ig）给药，给药前夜禁食不禁水，给药容量按体重计算0.2 mL/10 g，连续给药5 d。苦苣菜水提物各剂量组分别给予相应浓度的苦苣菜水提物，阳性对照组给予地塞米松磷酸钠溶液2mg/kg，模型组则分别给予等量生理盐水。

1.6 急性炎症模型的制备方法

二甲苯致耳肿胀模型：末次给药30 min后，于每只小鼠右耳内外两侧各均匀涂抹 100%二甲苯0.02 mL。致炎30 min后，脱颈椎处死小鼠，剪下小鼠左右耳，并用打孔器（直径 9 mm）分别在左、右耳同一部位打下等大的圆形耳片，称重，求左右耳片重量之差作为肿胀度。

角叉菜胶致足跖肿胀模型：末次给药 30 min后，于小鼠右后跖皮下注射1%角叉菜胶30 μL致炎，5 h后断头处死小鼠，取血，并从跟骨水平（踝关节中线以下）对称剪下鼠足，称重，以左右足重量差作为鼠足肿胀度。

肿胀抑制率（%） =（模型组肿胀度-给药组肿胀度）/模型组肿胀度×100%。

1.7 炎症相关细胞因子和炎性介质的含量测定

血清：室温血液自然凝固10～20 min，3000 r/min。收集上清，-20℃冰箱保存备用。保存过程中如出现沉淀，可再次离心。

炎性组织液：整个致炎小鼠足爪称重后，剪碎，放入3 mL 0.9%的生理盐水中，充分浸泡。在-4℃下以3000 r/min离心20 min，制得炎性组织液，-20℃冰箱保存备用。依据 ELISA试剂盒说明，应用双抗体夹心法，检测血清及炎性組织液中COX-2、p38 MAPK、TNF-α及IL-6水平。

1.8 统计学分析

采用SPSS20.0统计软件进行分析，计量资料以表示，多组间比较采用F检验，组内多重比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 苦苣菜水提物对二甲苯所致小鼠耳肿的影响

不同剂量组间小鼠耳廓肿胀度存在差异，高剂量组肿胀度明显低于中剂量组，中剂量组肿胀度明显低于低剂量组（P < 0.05）；与模型组相比，苦苣菜水提物不同剂量组小鼠耳廓肿胀均受到不同程度的抑制，且随着给药剂量的增大，抑制效果逐渐增强。见表1。

2.2 苦苣菜水提物对角叉菜胶所致小鼠足肿的影响

不同剂量组间小鼠足跖肿胀度存在差异，高剂量组肿胀度明显低于中剂量组，中剂量组肿胀度明显低于低剂量组（P < 0.05）；苦苣菜水提物不同剂量组小鼠足跖肿胀均受到不同程度的抑制，且随着给药剂量的增大，抑制效果逐漸增强。见表2。

2.3 苦苣菜水提物对小鼠炎性组织液中炎症相关因子的影响

阳性对照组、苦苣菜水提物中剂量、高剂量组的COX-2、p38 MAPK、TNF-α、IL-6水平与模型组相比均存在显著性差异（P < 0.05）。见表3。

2.4 苦苣菜水提物对小鼠血清中炎症相关因子的影响

阳性对照组、苦苣菜水提物中剂量的COX-2、p38 MAPK水平与模型组相比存在显著性差异（P < 0.05）；阳性对照组、苦苣菜水提物中剂量与高剂量组的TNF-α、IL-6水平与模型组相比存在显著性差异（P < 0.05）。见表4。

3 讨论

在我国历史上很早就有苦苣菜被当作药物使用的记载，在药学专著《神农本草经》和《本草纲目》中都详细记载了苦苣菜的药理作用，由于药性偏寒，味道较苦，被认为具有清热解毒、凉血止血等功效，在肠炎、痢疾、吐血等病症的治疗方面取得显著效果[4]。苦苣菜含有多种活性成分，除槲皮素、槲皮黄苷、吡喃葡萄糖苷等黄酮类成分外，还含有多种人体必需的微量元素，被认为是具有多靶点抗炎作用的传统中药[5]。本研究主要选取COX-2、p38 MAPK通路及相关因子TNF-α、IL-6 进行研究，探讨苦苣菜水提物的抗炎作用。

通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀和角叉菜胶诱导小鼠后足跖肿胀建立急性炎症模型，结果显示，苦苣菜水提物可明显改善二甲苯所致小鼠的耳廓肿胀与角叉菜胶所致小鼠的足跖肿胀，且在本实验范围内，随着苦苣菜水提物含量的增加，COX-2、p38 MAPK水平明显降低，且TNF-α以及IL-6因子水平明显下降，提示苦苣菜水提物具有明显的抗炎作用，与之前文献报道相一致[6-7]。

COX-2又称前列腺素过氧化物合成酶，是前列腺素（PG）合成过程中一个重要的限速酶，可以将花生四烯酸代谢成各种前列腺素产物，从而在机体的生理和病理过程中发挥作用[8]。研究发现，COX-2与哮喘、类风湿性关节炎、骨关节炎等多种炎症性疾病的发生发展密切相关[9]。在多种炎症性疾病的渗出液中均可检测到COX-2mRNA 和COX-2蛋白的高表达[10]。因此，近年来COX-2被作为新型非甾体抗炎药的作用靶点，从天然药物中筛选有效的COX-2抑制剂成为研发新型抗炎药物的有效途径。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。研究证实，MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应如细胞增殖、分化、转化及凋亡等[11]。目前均已发现存在着多条并行的MAPKs信号通路，哺乳类细胞主要存在以下三条并行的MAPKs信号通路：ERK（extracellular signal-regulated kinase）信号通路，JNK（c-Jun N-terminal kinase，JNK）/SAPK（stress-activated protein kinase，SAPK）通路与p38 MAPK通路。其中p38 MAPK通路在转录和翻译水平参与了炎症介质的合成调控，被认为是抗炎药物的重要靶点[12]。TNF-α是一种由内毒素激活的淋巴细胞所分泌的具有多活性的细胞因子，具有双重生物学作用，一方面是机体免疫防护的重要介质，另一方面也可参与机体的免疫病理损伤。TNF-α是迄今为止发现的具有抗肿瘤和炎症作用最强的细胞因子，同时还能刺激其他细胞因子如IL-4和IL-6的释放，扩大后者的生物效应，作为一种重要炎症介质为人们所重视[13]。IL-6被称为细胞因子的核心成员，是机体复杂的细胞因子网络中的重要成员。已证明在多种自身免疫及肿瘤性疾病中均有异常，并与这些疾病的病情严重程度相关。IL-6可诱导淋巴细胞的分化，刺激肝细胞合成急性期反应蛋白，后者可促进中性粒细胞的活化与聚集，催化和放大炎性反应，对组织细胞带来损害，因此被当作反映机体炎症和组织损伤严重程度的重要指标。IL-6不能刺激相应细胞分泌其他细胞因子，其主要免疫学功能是加强其他细胞因子的效果。许多研究表明，IL-6是某些自身免疫性疾病中的关键炎性因子，疾病的发生与转归密切相关[14]。本研究结果显示，苦苣菜水提物可不同程度抑制COX-2、p38 MAPK的生成，对炎症介质的合成起到有效的调控作用，进而缓解炎症的发生发展。

综上所述，苦苣菜水提物的抗炎机制涉及到炎症发生过程中的多个环节和炎症因子，具有多靶点作用抗炎药物的特点，符合目前抗炎有效药物的研究方向，有望研发成为有效的抗炎新药，为防治炎症性疾病提供新的药用和食疗资源。

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