MiR-105抑制肝癌细胞增殖能力的实验研究

李勇传，石永杰，嘉红云，黄思聪

(1.广州市红十字会医院检验科，广东广州510220；2.广州医科大学附属第二医院检验科，广东广州510260)

MiR-105抑制肝癌细胞增殖能力的实验研究

李勇传1，石永杰2，嘉红云2，黄思聪2

(1.广州市红十字会医院检验科，广东广州510220；2.广州医科大学附属第二医院检验科，广东广州510260)

目的探讨miR-105对人肝癌细胞增殖的影响及可能机制。方法改变QGY-7703及HepG2两种细胞的miR-105表达，细胞克隆形成实验和软琼脂增殖试验检测细胞增殖能力的改变；流式细胞仪检测细胞周期改变。结果细胞克隆形成和软琼脂增殖实验显示，过表达miR-105可抑制QGY-7703及HepG2细胞增殖，反之抑制miR-105表达则促进细胞增殖；细胞流式检测显示miR-105过表达能促进两种癌细胞G0/G1期阻滞。结论miR-105抑制肝癌细胞增殖，其机制与引起细胞周期阻滞有关。

MiR-105；肝细胞癌；细胞增殖；细胞凋亡

我国肝癌发病率高居恶性肿瘤病谱第四位，病死率为肿瘤死因谱第二位，且每年持续上升[1]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma cells，HCC)是目前肝癌的主要类型，尽管现在对肝癌的诊断和治疗方法较过去都有了很大的提高，但HCC的5年存活率仍然只有5%，且远期疗效很不理想[2]。现阶段HCC发生发展的机制还存在很多未知领域。研究表明，microRNA在HCC的病理进程中起重要作用，并可能成为HCC诊断和治疗的新方向[3]。近年发现miR-105对部分肿瘤来说可能是一个有效的抑癌基因[4-5]，但其对HCC的作用目前尚未清晰。因此本研究希望通过体外实验研究miR-105表达对QGY-7703及HepG2两种人类肝癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响，探讨miR-105在HCC发生发展中的作用和可能机制，为HCC的治疗提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞来源及培养肝癌细胞株QGY-7703和HepG2细胞由广州医科大学附属第二医院分子实验室留存，常规方法复苏后置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。取对数生长期细胞用于实验。

1.2 主要试剂胎牛血清(FBS)和DMEM培养液购自美国Gibco公司，TRIzol溶液、Lipofectamine 2000、Opti-MEI溶液购自美国Invitrogen公司。miR-105模拟物、miR-105抑制物、阴性对照购自广州市锐博生物科技有限公司。

1.3 细胞转染分别用阴性对照(NC)、miR-105模拟物(miR-105)和miR-105抑制物(miR-105-in)转染QGY-7703及HepG2细胞。用Opti-MEI稀释待转染核酸至浓度为0.02 μg/μL，加入LipofectamineTM2000/Opti-MEI混匀液，置室温20 min后加入待转染的贴壁细胞中，4～6 h后更换培养液为含10%FBS的DMEM，继续培养24 h。

1.4 克隆形成实验QGY-7703和HepG2细胞种于6孔板(每孔0.5×103个细胞)连续培养10 d，观察克隆(＞50个细胞的集落为1个克隆)的生长情况。用10%甲醛固定10 min，1.0%结晶紫染色5 min，倒置显微镜下计数克隆数量。结果以miR-105/NC、miR-105-in/NC克隆数量比值表示。

1.5 软琼脂增殖实验取2×103的QGY-7703和HepG2细胞悬浮在2 mL含有0.33%琼脂的完全培养基中。0.66%完全培养基琼脂混合物作为琼脂底层，琼脂细胞混合物作为琼脂上层。培养10 d后，用目镜测微尺计数克隆直径＞0.1 mm的细胞集落。

1.6 流式细胞仪检测细胞周期收集消化后的QGY-7703及HepG2细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后加入80%冰冷乙醇的PBS溶液固定。细胞沉淀后重悬，加入2 μg/mL牛胰RNA酶，37℃培养30 min，随后在10 μg/mL碘化丙啶中室温孵育30 min。流式细胞仪检测细胞DNA的含量，重复3次。

1.7 统计学方法用Exce2003进行数据整理，SPSS17.0进行统计学分析，计量数据以均数±标准差()表示，两组计量资料比较采用双侧t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-105表达对肝癌细胞增殖的影响克隆形成实验显示，与NC组比较，miR-105组的QGY-7703和HepG2细胞克隆数量比值为(0.28±0.08)、(0.22±0.06)(图1A)；miR-105-in组克隆数量比值分别为(2.80±0.30)、(3.20±0.50)(图1B)。软琼脂增殖实验显示，NC组的菌落数量约(50±5)个，miR-105组的QGY-7703和HepG2细胞菌落数量为(17±2)个、(15±1)个(图1C)；miR-105-in组克隆数量比值分别为(135±15)、(155±25)(图1D)。表明miR-105的过表达可导致QGY-7703和HepG2细胞克隆及菌落数量明显下降(P＜0.05)；抑制miR-105表达两种细胞的克隆及菌落数量则明显增多(P＜0.05)。

图1 miR-105在克隆形成和软琼脂增殖实验中对HCC细胞增殖的影响(与NC比较，aP＜0.05)

2.2 miR-105表达对肝癌细胞周期的影响与NC比较，miR-105过表达的两种细胞G1/G0期细胞所占比例均显著增加，差异有统计学意义(P＜0.05)，而抑制miR-105表达后，两种细胞G1/G0期细胞所占比例则显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 miR-105表达对HCC细胞G0/G1期比例的影响

3 讨论

miRNA的失调经常发生在各种人类肿瘤中，miRNA表达的异常可通过影响多个基因的表达最终导致人类癌症形成[6]。研究发现，在多种肿瘤类型中，miR-105表达都有改变，如前列腺癌患者的癌变组织和血中均发现miR-105表达下调，且在体外和体内的实验中证实其下调有助于前列腺肿瘤细胞的增殖[4]。结肠癌组织中也发现miR-105表达显著下调[7]。提示miR-105可能对部分肿瘤具有较大的抑制作用。

本次细胞实验结果显示，miR-105的过表达可导致肿瘤细胞的克隆及集落数量下降；反之抑制miR-105表达肿瘤细胞的克隆及集落数量明显增多。提示miR-105过表达可以抑制肝癌细胞的增殖，而抑制其表达，则使肝癌细胞增殖加速。说明对于HCC，miR-105有可能通过抑制肝癌细胞增殖而发挥其抑癌作用。

从一定意义上讲，肿瘤是多基因变化导致细胞周期紊乱，细胞失控性生长所导致的一类细胞周期性疾病[8]。一个完整的细胞周期有G0、G1、S、G2、M五个时期，细胞DNA的含量随各时相呈现周期性变化。流式细胞仪根据细胞增殖时各阶段的DNA含量不同，将细胞的复制期分为G0/G1、S、G2/M期。具有2C DNA含量的细胞为G0/G1期细胞，具有4C DNA含量的细胞为G2/M期细胞，DNA含量介于G1和G2期之间为S期细胞[9]。本次流式细胞检测发现，过表达miR-105能使QGY-7703和HepG2两种肝癌细胞处于G0/G1期的比例增多，表明miR-105有使肝癌细胞产生G0/G1期阻滞的能力，而抑制miR-105表达，癌细胞G0/G1期的比例减少，表示进入S期的细胞比例会相应增加。结果提示miR-105表达影响肝癌细胞增殖的机制可能与其影响细胞周期改变有关。

综上所述，miR-105也许在抑制HCC的发生和发展中起着重要的积极作用，有望能成为针对HCC治疗的有效作用靶点，为原发性肝癌的治疗提供新的治疗方向。

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MiR-105 suppress the proliferation of hepatocellular carcinoma cells.

LI Yong-chuan1,SHI Yong-jie2,JIA Hong-yun2,HUANG Si-cong2.1.Department of Clinical Laboratory,Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510220, Guangdong,CHINA;2.Department of Clinical Laboratory,the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of miR-105 expression on the proliferation of human hepatocellular carcinoma(HCC)cells.MethodsOver-expression of miR-105 was transfected by miR-105 mimics,and inhibition of miR-105 expression was transfected by miR-105 inhibitors.The effects of miR-105 expression on the proliferation of QGY-7703 and HepG2 cells were detected by colony formation assay and soft agar proliferation experiment. Flow cytometry was used to examine the influence of miR-105 expression on the cell cycle distribution of HCC cells. ResultsColony formation assay and soft agar proliferation experiment showed that,the proliferation of QGY-7703 and HepG2 cells were suppressed by miR-105 over-expression(P＜0.05),while miR-105 inhibitor accelerated the proliferation of HCC cells.The G0/G1phase cells dramatically increased in the miR-105 over-expressing QGY-7703 and HepG2 cells,while decreased in miR-105-inhibited cells.ConclusionMiR-105 inhibits the proliferation of HCC cells.The mechanisms may be related to the cell cycle arrested.

miR-105;Hepatocellular carcinoma;Cell proliferation;Cell apoptosis

R735.7

A

1003—6350（2017）07—1038—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.07.003

2016-10-11)

广东省广州市科技和信息化局项目(编号：2014J4100063)

黄思聪。E-mail：58218826@qq.com