米诺环素体外抑制弓形虫增殖作用的研究

赵莹，杨晓燕，陈顺仪，廖利银

（广州市番禺区中心医院检验科，广东广州511400）

米诺环素体外抑制弓形虫增殖作用的研究

赵莹，杨晓燕，陈顺仪，廖利银

（广州市番禺区中心医院检验科，广东广州511400）

目的评价米诺环素(MNC)体外抑制弓形虫速殖子的增殖作用。方法体外在96孔板中用Hela细胞培养弓形虫速殖子，设置SMX给药组、MNC给药组和未给药组。观察各组弓形虫速殖子的增殖情况、形态变化，并对各组进行活虫计数。结果给药后72 h，与未给药组比较，SMX给药组活虫计数显著减少[(2.08±0.40)vs (15.17±2.07)，P＜0.01]，MNC给药组活虫数亦显著减少[(1.42±0.20)vs(15.17±2.07)，P＜0.01]；给药后96 h，与未给药组相比，SMX给药组活虫计数显著减少[(1.42±0.20)vs（10.92±0.47)，P＜0.01]，MNC给药组活虫数亦显著减少[(1.92±0.33)vs(10.92±0.47)，P＜0.01]，差异均有统计学意义；给药后120 h，各组活虫计数比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论MNC在体外能够明显抑制弓形虫速殖子的增殖。

体外；弓形虫；米诺环素；速殖子

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生、呈世界性分布的机会性致病原虫，可引起广泛人畜共患感染。免疫正常人群感染后多表现为隐性症状，但免疫低下或免疫缺陷者感染后，可引起全身广泛弓形虫病。孕妇等特殊人群感染弓形虫可能导致严重后果，如早产、流产、死胎等[1]。宿主感染弓形虫后，寄生虫刺激机体产生特异性和非特异性免疫应答，巨噬细胞、T淋巴细胞、NK细胞及各细胞因子如白介素、γ-干扰素(IFN-γ)等发挥重要抗感染作用[2]。在弓形虫病治疗方面，经典药物如磺胺嘧啶、乙胺嘧啶等长期为临床使用，效果显著，但存在一定副作用，且不适用于孕妇。米诺环素(minocycline，MNC)是第二代半合成四环素类药物的衍生物。研究表明，MNC具有良好的抗炎、抗菌等作用，同时具有强大的神经保护作用，并且其相对分子量小，口服易吸收，可通过血—脑屏障[3]。本实验初步证实，体外米诺环素能显著抑制弓形虫速殖子增殖。

1 材料与方法

1.1 材料弓形虫RH株速殖子(中山大学吕芳丽教授惠赠)由昆明鼠传代保种。昆明鼠(Kunming, KM，6～8周)购自中山大学实验动物中心。小牛血清、RPMI 1640培养基购自美国HyClone公司，96孔细胞培养板、细胞培养瓶购自美国Corning公司。台盼蓝染液、双抗(青霉素、链霉素抗生素)购自美国Sigma公司。

1.2 细胞培养将Hela细胞培养于含5%CO2、37℃的CO2培养箱中，相对湿度为95%。培养液中加入10%小牛血清和双抗。在细胞生长旺盛时，消化收集并转入细胞培养板，每孔加入100 μL细胞培养液，其中含104个Hela细胞，培养24 h后，镜下观察细胞生长情况。各实验组均重复设置6孔，实验重复做一次。

1.3 药物米诺环素购自美国Sigma公司。磺胺甲噁唑片(SMX)为中国广州白云山药物有限公司产品。

1.4 体外实验96孔细胞培养板中，每孔加入1× 104个Hela细胞，体积为100 μL，培养24 h待细胞贴壁生长达90%以上，每孔加入5×104个弓形虫速殖子，体积为100 μL。两者共同培养2 h后吸去各孔培养液，再用细胞培养液冲洗两次以除去Hela细胞外的速殖子。加入制备好的MNC和SMX，设置MNC给药组、SMX给药组及未给药组。参照陈莉等[4]的实验方法，选取MNC的终浓度为100 μmol/L；参照赵莹等[5]的实验方法，选取SMX的终浓度为1 mg/mL。镜下观察给药后72 h、96 h、120 h 3个时间点弓形虫速殖子的增殖情况及其形态变化，并酚酞蓝染色以计数活虫数，分析减虫率[5]。

1.5 统计学方法应用SPSS19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差()表示，多组间均值比较采用方差分析，组间两两比较采用t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外观察各组弓形虫速殖子增殖情况给药72 h、96 h、120 h后，倒置荧光显微镜观察弓形虫速殖子增殖情况及形态变化(图1)。72 h，弓形虫速殖子在Hela细胞内大量增殖，形态大致正常。未给药组弓形虫速殖子增殖活跃，表现为高密度影，与之相比，MNC及SMX两给药组弓形虫速殖子密度强度显著减弱；镜下，各组均可见部分弓形虫速殖子从Hela细胞中释放出，形态正常，活力较好。96 h，所有实验组弓形虫速殖子密度强度均有所降低，未给药组弓形虫速殖子密度强度仍然高于两给药组；各组均可见部分弓形虫虫体肿胀、出现无活力的死虫。120 h，各实验组弓形虫速殖子密度强度均进一步减弱，这可能是由于药物的持续作用以及营养物质消耗，出现大量无活力死亡虫体。

图1 各实验组不同时间点弓形虫速殖子增殖情况(×40)

2.2 各组各时间点活虫计数酚酞蓝染色，计数各时间点各实验组活虫数见表1。72 h，与未给药组比较，MNC给药组和SMX给药组活虫数均显著降低(P＜0.01)。其中，SMX给药组活虫数进一步低于MNC给药组，但两组差异无统计学意义(P=0.493)。96 h，与未给药组比较，两给药组活虫数亦显著降低(P＜0.01)。120 h，各实验组活虫数均明显减少，出现大量死虫，各组间活虫数对比差异无统计学意义。与未给药组比较，SMX给药组在72 h、96 h、120 h减虫率分别为88.5%、86.9%、50.2%；MNC给药组在72 h、96 h、120 h减虫率分别为86.3%、82.4%、30.9%。说明SMX、MNC体外均能较好抑制弓形虫速殖子增殖，其中SMX作用效果更好。

表1 各实验组不同时间点活虫计数()

表1 各实验组不同时间点活虫计数()

注：每一组12个副孔；与未给药组比较，aP＜0.01。

组别120 h 72 h 96 h MNC给药组SMX给药组未给药组F值P值1.50±0.34 1.08±0.37 2.12±0.56 0.212 0.652 1.42±0.20a2.08±0.40a15.17±2.07 18.007 0.001 1.92±0.33a1.42±0.20a10.92±0.47 97.416 0.000

3 讨论

弓形虫寄生于除成熟红细胞之外的所有有核细胞，能侵入多种脏器甚至免疫豁免区引起严重弓形虫病[6]。作为机会致病性原虫，免疫低下人群罹患弓形虫病往往是致死性的。弓形虫感染引起T细胞介导的强烈的免疫反应，释放大量Th1型细胞因子如γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等。IFN-γ既可抑制弓形虫的繁殖，也是重要的巨噬细胞活化因子，在抗弓形虫感染中发挥重要作用[7]。同时研究证实，宿主感染弓形虫RH强毒株后，刺激IFN-γ、TNF-α等细胞因子的释放，这些细胞因子一方面发挥积极的抗感染作用，一方面由于其大量释放导致肝、脾等器官损伤，故在感染后期，机体Th2免疫应答增强以拮抗过度的Th1型免疫应答，使机体度过急性期并存活[8-9]。

治疗弓形虫病的经典药物为磺胺类药物，如磺胺嘧啶、乙胺嘧啶等，其作用机制为通过阻碍二氢叶酸的形成、影响核酸和蛋白质的合成，从而抑制弓形虫的生长与繁殖。但此类药物存在一定副作用，如产生骨髓抑制等，孕妇使用可能导致胎儿流产[10]。米诺环素为半合成四环素，在四环素类药物中抗菌作用最强，具有抗菌、抗支原体、衣原体等作用。研究显示，米诺环素能抑制多种炎症介质和细胞因子的产生，在抗炎、抗菌等免疫调节的同时亦具有强大的神经保护作用[3,11]。本实验旨在评价米诺环素体外抑制弓形虫速殖子增殖作用。

本研究显示：体外Hela细胞内，MNC和SMX均能较好的抑制弓形虫速殖子的增殖。72 h，与未给药组比较，MNC和SMX给药组活虫数均显著减少，表现为弓形虫密度影的显著降低，但两给药组之间活虫数差异无统计学意义；96 h，随着培养时间的延长和药物的作用，速殖子的增殖受到进一步抑制，并呈现异常形态，如虫体膨胀、活性减弱等，与未给药组比较，MNC和SMX两给药活虫计数显著减少，两给药组之间活虫计数差异无统计学意义；120 h，各实验组弓形虫密度均进一步减弱，各组间活虫计数差异无统计学意义，可能是由于药物的持续作用、营养物质消耗、代谢产物大量堆积，细胞环境不利于弓形虫生长，故出现大量死虫。

综上所述，米诺环素体外能较好地抑制弓形虫速殖子增殖。由于MNC在抗菌的同时可下调免疫应答，降低过度免疫反应对机体造成的伤害[12]，因此具有高效和长效性，在四环素类中，其抗菌作用最强。不仅如此，MNC还有一定的抗支原体、衣原体、真菌感染作用。本实验证实米诺环素体外具有一定抗弓形虫感染作用，为弓形虫病的治疗提供一个新思路。若生物体在感染弓形虫的同时感染对米诺环素敏感的细菌，使用MNC治疗或许能起到更好的效果。

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In vitro effects of Minocycline on the proliferation of Toxoplasma gondii.

ZHAO Ying,YANG Xiao-yan,CHEN Shun-yi,LIAO Li-yin.Department of Clinical Laboratory,Guangzhou Panyu District Central Hospital,Guangzhou 511400, Guangdong,CHINA

ObjectiveTo evaluate the in vitro effect of Minocycline on the proliferation of Toxoplasma gondii. MethodsThe T.gondii tachyzoites were cultured in Hela cells.The cells were divided into the SMX-treated group,Minocycline-treated group and untreated control group.Proliferation of the tachyzoites and morphological changes were observed,and the numbers of live tachyzoites at 72 h,96 h and 120 h were recorded after using drugs.ResultsAt 72 hours after treatment,compared with the untreated control group,the the numbers of live tachyzoites in SMX-treated group and Minocycline-treated group were significantly decreased[(2.08±0.40)vs(15.17±2.07),P＜0.01;(1.42±0.20)vs (15.17±2.07),P＜0.01].At 96 hours after treatment,compared with the untreated control group,the the numbers of live tachyzoites in SMX-treated group and Minocycline-treated group were significantly decreased[(1.42±0.20)vs(10.92± 0.47),P＜0.01;(1.92±0.33)vs(10.92±0.47),P＜0.01].At 120 hours after treatment,there were no significant difference in the the number of live tachyzoites among the three groups(P＞0.05).ConclusionMinocycline can inhibit T.tachyzoite proliferation in vitro.

In vitro;Toxoplasma gondii;Minocycline;Tachyzoites

R531.8

A

1003—6350（2017）07—1036—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.07.002

2016-10-11)

广东省广州市番禺区科技计划项目（编号：2015-Z03-18）

陈顺仪。E-mail：1277063279@qq.com