泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠血清IL-1β、IL-10及结肠黏膜CD14的影响*

河北省中医院

刘建平 吴鹤伶△ 郎晓猛 康 欣 赵 源 要翠翠△△(石家庄 050011)

实 验 研 究

泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠血清IL-1β、IL-10及结肠黏膜CD14的影响*

河北省中医院

刘建平 吴鹤伶△郎晓猛 康 欣 赵 源 要翠翠△△(石家庄 050011)

目的：通过动物实验证实泄浊解毒方对溃疡性结肠炎(UC)大鼠治疗有效，并探讨其可能作用机制。方法:将40只实验大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、柳氮磺吡啶组、中药高、低剂量组5组，除空白组外，其余4组均采用TNBS/乙醇联合造模法制造UC模型。分组灌胃治疗14 d后，分别检测大鼠血清IL-1β、IL-10、结肠黏膜CD14含量。结果：模型组较空白组IL-1β、CD14表达明显升高，IL-10表达明显下降，差异有显著性(P<0.05)；中药高、低剂量组、柳氮磺吡啶组较模型组IL-1β、CD14表达明显下降，IL-10表达明显升高，差异有显著性(P<0.05)；中药高剂量组较柳氮磺吡啶组、中药低剂量组IL-1β、CD14表达明显下降，IL-10表达明显升高，差异有显著性(P<0.05)。结论：泄浊解毒方干预UC大鼠可降低血清IL-1β、升高血清IL-10、下调结肠黏膜CD14表达，这可能是其作用机制之一。

泄浊解毒方；溃疡性结肠炎；肠澼；下利；小肠泄；IL-1β；IL-10；CD14；浊毒

溃疡性结肠炎(UC) 流行于世界各地，好发于青年人，是一种慢性反复发作性、非特异性疾病，严重影响患者的生活质量，甚至可危及生命。[1]其病变范围以直肠、乙状结肠为主，甚者可达全结肠。现代医学认为，UC的发病与遗传、免疫、感染及环境等多种因素有关。白细胞介素-1β(IL-1β) 被认为是诱发UC的重要细胞因子之一，因为其可趋化炎性细胞进入结肠病变部位，从而引发小血管炎、上皮损伤、隐窝脓肿等炎症反应。[2]IL-10可阻断免疫炎性反应发生发展的多重环节，还可调节促炎细胞因子与抗炎细胞因子间平衡、稳定肠道黏膜内环境。白细胞分化抗原14 (CD14)是一种特异性巨噬细胞表面标志物，巨噬细胞在其与脂多糖(LPS) 结合后被激活，而后获得多种增强活性，此过程在介导炎症性肠病中发挥关键作用。[3]此次动物实验证实，应用泄浊解毒方干预UC大鼠后疗效显著，为探讨其可能机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本次实验所用健康清洁级Wistar雄性大鼠40只，由河北医科大学实验动物中心供给，大鼠体质量220～250g，动物等级：一级，动物合格证号：1404052。

1.2 药物与试剂 ⑴泄浊解毒方药物组成：鱼腥草、败酱草各15g，车前子10g，红藤15g，葛根、薏苡仁各20g，半夏9g，黄芩12g，黄连、木香各9g。由河北中医学院附属医院中药房提供。采用中药颗粒配方，浓缩后所制得液体每毫升含生药2.0g，4℃冰箱低温保存备用；柳氮磺吡啶(SASP)，250mg/片，按 0.3g/kg体质量灌胃给药(相当于成人用药量的10倍)，由上海三维制药有限公司生产，生产批号：200609C15。⑵主要试剂：三硝基苯磺酸(TNBS),东京化成工业株式会社生产；IL-1β放免试剂盒，北京北方生物技术研究所生产；IL-10酶联免疫试剂盒，上海森雄科技实业有限公司生产；CD14抗bs-1192RBeujingBiosynthesisBiotechnologyCO.TTD。

1.3 实验方法 将大鼠40只随机分为空白对照组(BK)、模型对照组(MK)、柳氮磺吡啶组(LK)、中药高剂量组(GK)、中药低剂量组(DK)，共5组，每组8只。参照相关文献[4]建立UC大鼠模型。模型建立3d后开始灌胃治疗：空白组常规饮食；模型组2mL生理盐水灌胃；柳氮磺吡啶组SASP混悬液按0.3g/kg灌胃；中药高剂量组、中药低剂量组分别以中药高剂量20.0g/kg、中药低剂量10.0g/kg灌胃。各实验组大鼠每日给药1次，连续14d。

1.4 标本采集 各组大鼠持续给药14d后，禁食不禁水24h，以水合氯醛注射麻醉，断头处死，取全血2～4mL，离心机3 000r/min离心10min，血清储存至冰箱，温度设定为-20℃。沿矢状线正中分层解剖UC大鼠，截取肛门至回盲部结肠组织，选取病变最严重部位作为实验标本。

1.5 指标检测 用放射免疫法检测IL-1β水平，酶联免疫法检测IL-10水平，免疫组化法检测大鼠结肠黏膜CD14水平。各试剂操作使用时严格遵守试剂盒步骤。

2 结果

5组大鼠血清IL-1β、IL-10含量及大鼠结肠黏膜CD14表达情况比较，与空白组比较，模型组IL-1β、CD14表达明显升高，IL-10表达明显下降，差异有显著性 (P<0.05)；与模型组比较，中药高、低剂量组、柳氮磺吡啶组IL-1β、CD14表达明显下降，IL-10表达明显升高，差异有显著性 (P<0.05)；与柳氮磺吡啶组、中药低剂量组比较，中药高剂量组IL-1β、CD14表达明显下降，IL-10表达明显升高，差异有显著性(P<0.05)；柳氮磺吡啶组与中药低剂量组相比，差异均无显著性(P>0.05) 。详见表1。

组别例数 IL-1β IL-10CD14空白对照组8 0.108±0.010*39.24±6.31*0.078±0.035*模型对照组8 0.205±0.00922.03±2.820.348±0.056中药高剂量组8 0.133±0.010*37.60±2.55*0.162±0.042*中药低剂量组8 0.167±0.016*▲△30.12±3.38*▲△0.246±0.047*▲△柳氮磺吡啶组8 0.169±0.009*▲28.98±3.90*▲0.236±0.043*▲

注：与模型组相比，*P<0.05；与高剂量组相比，▲P<0.05；与柳氮磺吡啶组相比， △P>0.05

3 讨论

现代医学认为，UC的发病与促炎细胞因子、抗炎细胞因子二者间平衡失调所导致的免疫异常关系甚密。[5]研究表明[6-7]，IL-1β作为一种强烈的促炎细胞因子，一方面可促进炎症细胞的活化与聚集，并通过自分泌或旁分泌来刺激相关细胞因子与炎症递质的产生，相互影响,诱发UC；另一方面血管内皮-白细胞黏附分子可因IL-1β而表达增强，促使炎细胞进入肠道，引发结肠上皮损伤、小血管炎、隐窝脓肿等破坏。IL-10是典型的抗炎与免疫抑制性细胞因子，发挥着重要的负向调节作用。主要包括通过抑制巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞等产生IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子和趋化因子，从而阻断免疫调节、炎症发生发展的多个环节。Hale研究发现[8]，小鼠若缺失IL-10会发生自发性UC。

作为一种特异性巨噬细胞表面标志物,CD14可与LPS高度结合。LPS/脂多糖结合蛋白(LBP)复合物可与细胞膜上的CD14相互作用，CD14进一步参与Toll样受体(TLR)/核因子-κB(NF-κB)通路，导致巨噬细胞激活,产生多种前炎症因子，促使炎症反应发生。有研究表明[9-10]， 因为LBP/CD14的存在，极小量的LPS就可诱发炎症因子释放,而消除或拮抗LBP/CD14则可大幅度降低炎症效应。

UC归属于中医学中“肠澼”“下利”“小肠泄”等范畴，临床上主要表现为腹痛、腹泻、里急后重、黏液脓血便等，内镜下可观察到黏膜充血、水肿、糜烂、溃疡等病理改变。我们提出“浊毒内蕴”的发病观，其中“浊与湿同源，湿乃浊之源，浊乃湿之甚”，[11]浊为阴邪，易损伤阳气，阻碍气机，其与湿同类，性黏滞难祛；“毒与热同源，热乃毒之渐，毒乃热之极”，[11]毒为阳邪，易损伤气阴，耗气伤津，毒邪入血入络，则可导致疮疡。“浊”与“毒”二邪常常相兼为病，称为“浊毒”之邪。浊毒聚集于肠道，损伤肠道脂膜血络，出现血败肉腐，并壅滞成脓；日久内聚不散化为瘀，影响肠道正常传导功能，从而诱发UC。

在“浊毒致病”理论指导下，总结多年临床实践，筛选出经验方“泄浊解毒方”。泄浊升清、解毒祛瘀为其治疗大法。方中鱼腥草、车前子合为君药，奏清热解毒，利湿化浊功效；败酱草、红藤、半夏、黄芩、黄连为臣药，辅助君药之时还有活血祛瘀止痛之效；葛根、薏苡仁为佐药，奏健脾止泻，升清降浊之功；木香引诸药直达病变部位，为使药。

鱼腥草清热解毒、消痈排脓，在《岭南采药录》中记载：“煎服能去湿热，治痢疾；鱼腥草六钱……”药理学研究证实鱼腥草具有良好的抗炎作用，[12]鱼腥草注射液可抑制血清中IL-1β的量，[13]其水提物可提高肌体的免疫力。[14]车前子清热利尿、渗湿止泻，《本草纲目》记载：“导小肠热，止暑湿泻痢。”现代研究证实从车前子中提取的多糖、黄酮及麦角甾苷等成分具有抗氧化作用，并可调节免疫、抑制炎症、抗击肿瘤。[15]二者共为君药。 红藤清热解毒、活血止痛，是治疗肠痈腹痛的要药，《闽东本草》曰：“治心腹绞痛，赤白痢疾。”王氏[16]等经体外抗菌实验表明红藤制剂对大肠埃希菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌的标准株、临床株都有抑菌作用，对后两者的作用尤为明显。败酱草清热解毒、消痈排脓、祛瘀止痛，《本草纲目》录“善排脓破血”，《本草会编》录“明目，主诸痢”，临床试验发现，[17]一定剂量的黄花败酱的根部甲醇提取物与氨基水杨酸比较，效果更为显著。半夏燥湿化痰、消痞散结，《名医别录》曰：“消心腹胸膈痰热满结，咳嗽上气，心下急痛坚痞，时气呕逆；消痈肿。”研究发现，半夏具有抗炎、抗肿瘤作用，[18]经典方半夏泻心汤可使UC模型组CD4T淋巴细胞升高，CD8T淋巴细胞下降，使得CD4与CD8的比值与正常对照组比较显著升高。[19]黄连、黄芩清热燥湿、泻火解毒，黄连被称为“治痢要药”，《神农本草经》记录其“主热气目痛……肠澼腹痛下痢”；黄芩“主诸热黄疸，肠澼，泄利，逐水，下血闭”。现代药理研究表明，黄连中的多种成分均有抗菌作用，[20]黄连甲醇提取液具有抗炎、免疫调节作用，[21]小檗碱具有抗消化道溃疡[22]、抗肿瘤作用[23]。黄芩提取物黄芩素对LPS诱导的炎症反应有负向调节作用，提取物黄芩苷也具有一定的抗炎作用。[24]葛根升阳止泻擅治脾虚泄泻。《日华子本草》云：“……止血痢，通小肠，排脓破血。”葛根的主要活性成分之一葛根素具有抗脂质过氧化和驱除自由基的作用，葛根黄酮具有解痉、增强肌体免疫力作用。薏苡仁健脾止泻、清热排脓，《本草纲目》云：“薏苡仁，阳明药也，能健脾益胃。”发挥抗菌抗炎作用，关键依赖薏苡仁内酯这一主要成分，[25]抗癌细胞增殖作用主要依赖薏苡仁甘油酯类。[26]木香行气止痛，行大肠之气使肠道气机调畅，则大便通利，解除里急后重不适感。《日华子本草》载：“治心腹一切气，止泻，霍乱，痢疾，安胎，健脾消食。”孙氏[27]通过临床观察研究发现，香连丸(木香、黄连)可明显上调活动期UC患者外周血及肠黏膜内自然杀伤T细胞(NKT)、γ干扰素(IFN-γ)和TNF-α的含量，提示对NKT的调节作用可能是其治疗活动期UC的免疫机制之一。此外香连丸还具有抗菌、抗腹泻、调节胃肠功能[28]等作用。

本实验结果表明：UC大鼠血清IL-1β含量升高、血清IL-10含量降低、结肠黏膜CD14含量明显升高，说明大鼠血清IL-1β、IL-10、黏膜CD14与UC发病密切相关。经泄浊解毒方干预后，UC大鼠血清IL-1β、结肠黏膜CD14含量明显下降，血清IL-10含量明显升高，说明泄浊解毒方可降低UC大鼠血清中IL-1β含量、升高IL-10含量，平衡了促炎因子与抗炎因子间的作用，减轻炎症反应；同时通过对结肠黏膜中高表达的CD14产生下调作用，以抑制因LPS刺激导致的多种免疫活性细胞激活，减少炎性细胞的释放，抑制炎症反应。这可能是泄浊解毒方治疗UC的作用机制之一。

[1]罗丹，仝战旗. 中医药治疗溃疡性结肠炎的临床研究进展[J]. 医学综述,2017,23(2):336-339

[2]李艳颖,陈津生.IL监测溃疡性结肠炎病情变化的研究进展[J]. 天津医科大学学报,2006(4):597-599

[3]吴思梦,徐德魁,郑长青. 炎症性肠病患者肠黏膜白细胞分化抗原-14的表达及意义[J].世界华人消化杂志,2009, 24:2 526-2 529

[4]吴小庚. 实验性溃疡性结肠炎大鼠模型的建立[J]. 河北医药， 2011, 33(4): 493-495

[5]Sanchez-MunozF,Dominguez-LopezA,Yamamoto-FurushoJK.Roleofcy-tokinesininflammatoryboweldisease.WorldJGastroenterol, 2008, 14 (27)4 280-4 288

[6]康静静,姚华伟,梁宏德,等.细胞因子在炎症性肠病中的作用[J]. 中国细胞生物学学报,2011(2):204-209

[7]PopeRM,TschoppJ.Theroleofinterleukin-1andtheInflammasomeingout：implicationsfortherapy[J].ArthritisRheum, 2007, 56: 3 183-3 188

[8]HaleLP,GreerPK.Anovelmurinemodelofinflammatoryboweldiseaseandinflammation-associatedcoloncancerwithulcerativecolitislikefeatures[J].PLoSOne, 2012,7(7):e41 797

[9]TanakaK.ExpressionofToll-likereceptorsintheintestinalmucosaofpatientswithinflammatoryboweldisease[J].ExpertRevGastroenterolHe-patol, 2008(2): 193-196

[10]TanakaT,OkanobuH,KugaY,etal.Clinicalandendoscopicfeaturesofrespondersandnon-responderstoadsorptiveleucocytapheresis:areportbasedon120patientswithactivelcerativecolitis[J].GastroenterolClinBiol, 2010, 34: 687-695

[11]刘启泉.慢性胃炎从浊毒论治[J].北京中医药大学学报,2010,33(3)：153-155

[12]陈婧，方建国，吴方建，等. 鱼腥草抗炎药理作用机制的研究进展[J].中草药,2014,42(2):284-289

[13]张美玉，李贻奎，闫位娟，等. 鱼腥草注射液新制剂抗炎解热作用及其机制研究 [J]. 中国新药杂志,2010, 19(9):775-779

[14]DuSH,LiH,CuiYH.Houttuyniacordatainhibitslipopolysaccharideinduc-edrapidpulmonaryfibrosisbyup-regulatingIFN-γandinhibitingtheTGF-β1/Smadpathway[J].IntImmunopharmacol,2012, 13(3)：331-340

[15]王芳，王敏. 车前子的新药理作用及机制的研究进展[J].医学综述，2013,19(19)：3 562-3 654

[16]王宇歆，李惠芬，周静，等.大血藤有效部位含量测定及对腹腔感染细菌的抑制活性的研究[J]. 中成药,2008, 30(8) :1 230-1 232

[17]Eu-jinCho,Ji-SunShin，Young-SuNoh,etal.Anti-inflammatoryeffectsofmethanolextractofPatriniascabiosaefoliainmicewithulcerativecolitis[J].Journalofethnopharmacology, 2011, 136(3)：428-435

[18]龚道锋，王甫成，纪东汉，等. 中药半夏化学成分及其药理、毒理活性研究进展[J]. 长江大学学报，2015,12(18)：77-79

[19]宋小莉.半夏泻心汤对溃疡性结肠炎大鼠T细胞亚群CD4,CD8 的影响[J].微循环学杂志,2011,21(2):97

[20]LINNYC,LUJ，LIMLC,etal.Berberine-inducedhaemolysisrevisited:safetyofRhizomaCoptidisandCortexPhellodendninchronichaematologicaldiseases[J].PhytotherRcs，2012,26(5):682

[21]MABL，MAYM.，GAOCL.etal.LipopolysaccharideincreasedtheacutetoxicityoftheRhizomacoptidisextractinmicebyincreasingthesystemicexposuretoRhizomaCoptidisalkaloids[J].JEthnopharmaco1,2011.138(1):169

[22]钟祥，李应东.小檗碱药理作用研究进展[J].亚太传统医药，2012,8(3):185-186

[23]SATOHK,FUKUMOTOY.SHIMOKAWAH.Rho-kinase:importantnewtherapeutictargetincardiovasculardiseases[J].AmJPhysi-HeartandCircPhysi, 2011,301(2):287

[24]FanGW,ZhangY,JiangX,etal.Anti-inflammatoryactivityofbaicaleininLPS-stimulatedRAW264.7macrophagesviaestrogenreceptorandNF-κBdependentpathways[J].Inflammation, 2013,36: 1 584-1 591

[25]金黎明，刘垠孜，赵晓蕾，等.薏苡仁有效成分研究进展[J].安徽农业科学,2011,39(10):5 734-5 750

[26]张明发，沈雅琴. 薏苡仁油抗消化系肿瘤的基础和临床研究[J].中国执业药师,2011,8(8):19-23

[27]孙莺.香连丸对活动期溃疡性结肠炎患者自然杀伤T细胞功能的调节作用[J].长治医学院学报,2013,27(4):244-246

[28]王晶，郝正一，刘仁慧. 黄连与木香的配伍研究进展[J]. 继续医学教育,2016,30(5):149-150

(2016-07-12 收稿)

Effect ofXiezhuoJieduFangon IL-1β and IL-10 in Serum and CD14 of UC Rats Hebei Hospital of Traditional Chinese Medicine

LIUJian-pingWUHe-lingLANGXiao-mengKANGXinZHAOYuanYAOCui-cui

(Shijiazhuang 050011)

Objective: to validate through animal experiments the effect ofXiezhuoJieduFangonUCratsandtoexploreitspossiblefunctionalmechanism.Methods: 40ratswererandomlydividedintocontrolgroup,modelgroup,sulfasalazinegroup,highdoseandlowdosegroupoftheChinesemedicine.Exceptcontrolgroup,therestfourwerepreparedintoUCmodelsbycombinedmethodofTNBSandalcohol,whichweretreatedwithintragastricadministrationfor14days,followedbydetectingthecontentsofIL-1βandIL-10andCD14.Results:comparedtocontrolgroup,IL-1βandCD14ofmodelgroupexpressionsincreased,andIL-10decreasedbothwithsignificantdifference(P<0.05);comparedtomodelgroup,IL-1βandCD14ofhigh,lowdosegroupsandsulfasalazinegroupdecreasedandIL-10increasedallwithsignificantdifference(P<0.05);comparedtolowdosegroupandsjlfasalazinegroup,IL-1βandCD14ofhighdosegroupdecreasedandIL-10increasedwithsignificantdifference(P<0.05).Conclusion:XiezhuoJieduFangcandecreaseserumIL-1βandCD14expressions,andincreaseIL-10,whichmightbeoneofthefunctionalmechanisms.

XiezhuoJieduFang；UC(ulcerativecolitis)；dysentery；diarrhea；smallintestinaldiarrhea；IL-1β；IL-10；CD14；turbidtoxin

*河北省自然科学基金资助项目：No.H2014206462

郎晓猛，男，硕士，主治医师。

R

A

1007-5615(2017)02-0001-04

△石家庄市中医院(石家庄 050051)

△△河北医科大学研究生学院(石家庄 050017)