化瘀解毒中药对梗阻性肾病大鼠肾脏类肝素酶表达的调控作用*

河北医科大学第一医院

马国平 贾彦存△郝 娟△△王佳磊△△△杨 帆△△张 宇△△梁文杰△△(石家庄 050030)

化瘀解毒中药对梗阻性肾病大鼠肾脏类肝素酶表达的调控作用*

河北医科大学第一医院

马国平 贾彦存△郝 娟△△王佳磊△△△杨 帆△△张 宇△△梁文杰△△(石家庄 050030)

目的：观察化瘀解毒中药对梗阻性肾病大鼠肾脏类肝素酶(Hpa)表达的影响，以探索其拮抗炎症损伤的机制。方法：采用单侧输尿管结扎手术复制梗阻性肾病模型；采用real-timePCR技术检测肾组织HpamRNA的表达；采用SABC法检测肾组织Hpa蛋白的表达。结果：与假手术组比较，模型组大鼠肾组织HpamRNA及蛋白表达上调(P<0.01)；与模型组比较，中药组肾组织Hpa表达下降(P<0.01)。结论：化瘀解毒中药可下调梗阻性肾病大鼠肾脏Hpa表达从而减轻炎症损伤。

化瘀解毒中药；类肝素酶；梗阻性肾病；炎症损伤

在慢性肾脏病进程中，常伴随炎症反应及其导致的炎症损伤，而巨噬细胞及中性粒细胞等炎细胞的活化和浸润是肾组织炎症反应的重要病理特征。炎细胞浸润需穿越基底膜和细胞外基质(ECM)，硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)是其主要成分之一，而类肝素酶(Hpa)可裂解HSPG的硫酸乙酰肝素(HS)侧链。故而Hpa促进细胞侵袭，在炎细胞浸润中起着极其重要的作用。本实验采用大鼠单侧输尿管结扎(UUO)方式，复制梗阻性肾病病变，给以化瘀解毒中药干预治疗，观察Hpa在UUO大鼠肾组织的表达，并观察化瘀解毒中药的调控作用，以探索炎症损伤的分子机制，从而为慢性肾脏病的中药治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 RNA提取试剂盒为美国Omega Bio-Tek公司产品，批号：00R6934010000L18O094；SYBR Green荧光定量PCR试剂盒为Vazyme Biotech Co.，Ltd产品，批号402151；Hpa抗体为美国Proteintech产品，批号00036315。实时荧光定量基因扩增仪，美国 Applied Biosystems 公司，型号：7500 Fast；超微量紫外分光光度计，型号：ND-2000，美国thermo scientific公司；显微镜，日本奥林巴斯，型号：VANOX DM-10AD。

1.2 动物分组及模型制备 清洁级雄性SD大鼠，8周龄，体质量(180±20)g，购于河北医科大学实验动物中心，合格证编号: 1605369。30只SD大鼠随机分为假手术(SHAM)组、模型(UUO)组及中药(TCM)组，每组10只。大鼠单侧输尿管梗阻模型制备参照 Qian HS 方法。[1]

1.3 药物及干预方法 化瘀解毒中药(黄芪、醋鳖甲、僵蚕、乌梢蛇、地龙、赤芍、丹参、黄芩、金银花、蒲公英、大黄)采用广东一方制药有限公司免煎颗粒中药，常规煎煮。术后开始给药，TCM组给予化瘀解毒中药煎剂生药含量13.7 g/kg·d-1，SHAM组及UUO组给予等容量生理盐水。连续干预10 d。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 肾组织Hpa mRNA 表达检测:采用 Real-time PCR 法。常规提取肾组织总RNA，反转录为cDNA，扩增。Template 1 μL，4×Gdna wiper Mix 10 μL，ddH2O 6.6 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，Forward primer(10 μM) 1 μL, Reverse primer(10 μM)1 μL，Total volume 20 μL。扩增条件：95℃预变性2 min，两步法循环反应(95℃10 sec，60℃ 1 min)40个循环，融解曲线95℃ 15 sec，60℃ 60 sec，95℃ 15 sec。引物由 Invitrogen 公司合成，Hpa：Forward primer: 5'-ctctctcctgttcaagaaact-3'，Reverse primer: 5'-ttcccgataccttgggtgatag-3'；GAPDH：Forward primer: 5'-ttgtcagcaatgcatcctgc-3'，Reverse primer: 5'-cggcatgtcagatccacaac-3'。以GADPH为内参照基因，得到目的基因的Ct值，以RQ值表示基因相对表达量，RQ=2-△△Ct。

1.4.2 免疫组化(SABC)法检测Hpa蛋白表达:[2]石蜡切片脱蜡、水化，0.01 M PBS清洗3次，5 min/次；室温下0.3%H2O2孵育20 min；同上清洗；0.01 M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)微波炉内热修复，98℃20 min；冷却后同上清洗 ，滴加山羊血清封闭液，37℃湿盒孵育30 min；吸去多余封闭液，加入兔抗鼠Hpa一抗(1∶100)，4℃过夜；同上清洗 ；滴加生物素标记的羊抗兔二抗，37℃湿盒孵育1 h；同上清洗；滴加 SABC 复合物，37℃湿盒孵育30 min；同上清洗；DAB显色；蒸馏水冲洗；苏木素复染；梯度酒精脱水；二甲苯透明；中性树胶封片。显微镜观察Hpa表达情况及位置，以光镜下出现棕黄色颗粒为阳性表达。医学图文图像分析系统分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0 统计软件进行数据分析。

2 结果

2.1 各组大鼠肾脏Hpa mRNA表达比较 与假手术组比较，模型组大鼠肾脏Hpa mRNA表达明显上调(P<0.01)；而与模型组比较，中药组大鼠肾脏的HpamRNA表达明显下调(P<0.01)。详见表1、图1。

组别nmRNA(RQ) 假手术组100.855±0.249 模型组1011.682±1.105*中药组103.417±0.980△

注：与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01

注：与假手术组比，﹡P<0.01；与模型组比，△P<0.01

图1 各组大鼠肾组织Hpa mRNA表达比较

2.2 各组大鼠肾组织Hpa蛋白表达 免疫组化结果显示，假手术组大鼠肾脏Hpa蛋白微量表达；与假手术组比较，模型组肾脏Hpa表达明显增强(P<0.01)，主要表达在远端小管及部分肾间质；与模型组比较，中药组肾脏Hpa表达明显减弱P<0.05。详见表2及图2。

组别nHpa平均光度值假手术组100.174±0.026 模型组100.310±0.050*中药组100.243±0.057△

注：与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.05

注：A为假手术组；B为模型组；C为中药组

3 讨论

各种慢性肾脏病发展为终末期肾病的重要原因是肾脏炎症反应及其组织损伤，炎细胞的活化和浸润是微生物性及非微生物性炎症的共有特征。在梗阻性肾病，肾小管损伤、基质堆积及炎细胞浸润是常见的病理表现。[3]前期研究显示，[4]模型组大鼠患侧肾脏肾组织单核细胞趋化因子1等炎性因子表达明显上调，炎细胞浸润明显，但确切机制尚不完全清楚。炎细胞浸润必须穿越基底膜和ECM，HSPG是其主要成分之一，HSPG是一种高硫酸化的多聚糖，遍布ECM及细胞表面。而Hpa是唯一获知的哺乳动物糖苷内切酶，可裂解HSPG的HS侧链， HS链联结并组装ECM蛋白，对于ECM的完整性及阻滞功能十分重要。Hpa通过降解HS链重构ECM，促进炎细胞浸润，影响着炎症反应，甚至促进蛋白尿形成及肾纤维化进程。[5-6]Hpa基因敲除鼠的肾实质未见显著的巨噬细胞浸润，而野生鼠浸润明显。[7]肾脏炎性细胞浸润严重的慢性肾炎患者，肾组织Hpa表达往往增强，炎细胞浸润处更甚。[8]本实验显示，模型组大鼠肾脏Hpa mRNA及蛋白的表达明显上调，有利于巨噬细胞等炎细胞穿越血管壁及ECM，从而加重炎症反应。

Hpa通过降解HS产生透明质酸、核心蛋白聚糖、可溶性二聚糖等，这些裂解产物是Toll样受体(TLRs)的配体，可与巨噬细胞胞膜的TLR2及TLR4结合，活化的TLRs进一步激活NF-κB，NF-κB转位胞核，启动TNFα、MCP-1及IL-1等炎性因子的基因表达。Hpa可使细胞膜的HSPG发生构象改变而激活TLRs。故Hpa不仅促进炎细胞浸润，而且可以激活巨噬细胞，诱导炎性因子表达。而活化的巨噬细胞产生TNFα增多，TNFα介导Egr1转录因子(Hpa的强力诱导剂)的活化，进一步上调Hpa表达。[9]这样Hpa与巨噬细胞相互作用，加速并加重了肾脏炎症损伤。

某些中药复方可抑制肾脏Hpa表达，Sun W等[10]报道，益气养阴方(地黄、山药、生黄芪、党参、丹参、当归、茯苓、益母草、白术、龟甲)可能通过抑制肾脏Hpa表达而减轻肾小球足突损伤，改善蛋白尿。炎细胞浸润及炎性因子产生为“浊毒”的物质基础，本研究显示，化瘀解毒中药可从基因、蛋白水平上明显抑制Hpa表达，减弱肾脏浊毒的形成。Hpa表达减少可降低巨噬细胞等炎细胞的浸润，并抑制巨噬细胞活化，减少炎性因子的生成，从而减轻肾脏炎症损伤，改善肾功能。化瘀解毒中药中的地龙、僵蚕、蝉蜕、鳖甲等可化瘀通络，大黄、黄芩、金银花、蒲公英等可解毒泻浊，加之赤芍、丹参的活血作用及黄芪的益气作用，使其在临床上具有较好的减轻炎症损伤、改善肾功能的功效。

[1]QianHS,WeldonSM,MateraD,etal.QuantificationandComparisonofAnti-FibroticTherapiesbyPolarizedSRMandSHG-BasedMorphometryinRatUUOModel[J].PLoSOne,2016,11(6):e0156 734

[2]FangX,TaoD,ShenJ,etal.NeuroprotectiveeffectsanddynamicexpressionsofMMP9andTIMP1associatedwithatorvastatinpretreatmentinischemia-reperfusionrats[J].NeurosciLett,2015,603:60-5

[3]LuH,BaiY,WuL,etal.InhibitionofMacrophageMigrationInhibitoryFactorProtectsagainstInflammationandMatrixDepositioninKidneyTissuesafterInjury[J].MediatorsInflamm,2016,2016:2 174 682

[4]王筝,梁丽娟,王聪慧,等.肾络通煎剂对梗阻性肾病大鼠肾间质纤维化的影响[J].中国中西医结合杂志,2014,34(10):1 238-1 244

[5]GoldbergR,RubinsteinAM,GilN,etal.Roleofheparanase-driveninflammatorycascadeinpathogenesisofdiabeticnephropathy[J].Diabetes,2014,63(12):4 302-4 313

[6]MasolaV,ZazaG,OnistoM,etal.Heparanase:anotherrenalplayercontrolledbyvitaminD[J].JPathol,2016,238(1):7-9

[7]GilN,GoldbergR,NeumanT,etal.Heparanaseisessentialforthedevelopmentofdiabeticnephropathyinmice[J].Diabetes,2012,61(1):208-16

[8]余荣杰, 赵洪雯, 李敛,等.肾组织炎症细胞浸润与其类肝素酶高表达相关[J].第三军医大学学报, 2008, 30(5):447-449

[9]VlodavskyI,BlichM,LiJP,etal.Involvementofheparanaseinatherosclerosisandothervesselwallpathologies[J].MatrixBiol,2013,32(5):241-51

[10]SunW,HeY,YuJ,etal.Effectofyiqiyangyinrecipeonheparanaseandnephrininratswithadriamycin-inducednephropathy[J].JTraditChinMed,2013,33(3):334-342

(2016-12-30 收稿)

Effect of Stasis-resolving and Toxin-removing Chinese Medicine on Heparanases Expression in Obstructive Nephropathy Rats First Hospital of Hebei Medical University

(Shijiazhuang 050030)

MAGuo-pingJIAYan-cunHAOJuanWANGJia-leiYANGFanZHANGYuLIANGWen-jie

Objective: to observe the effect of stasis-resolving and toxin-removing Chinese medicine on heparanases (Hpa) expression in obstructive nephropathy rats so to explore its mechanism of anti-inflammatory injury. Methods: Take unilateral ureteral obstruction to duplicate obstructive nephropathy models; take real-time technique to detect Hpa mRNA expression; take SABC to detect Hpa protein expression. Results: compared to sham operation group, Hpa mRNA expression of model group increased (P<0.01);comparedtomodelgroup,Hpaexpressionofmedicinegroupdecreased(P<0.01).Conclusion:Stasis-resolvingandtoxin-removingChinesemedicinecandecreasetheHpaexpressioninobstructivenephropathyratsandsoastolightentheinflammatoryinjury.

stasis-resolving and toxin-removing Chinese medicine; heparanases (Hpa); obstructive nephropathy; inflammatory injury

*河北省科技计划项目：No.152777208

梁文杰，男，副教授，硕士生导师。

R

A

1007-5615(2017)02-0005-03

△河北省安平县医院

△△河北中医学院 河北省中西医结合肝肾病证重点实验室

△△△河北医科大学(石家庄050017)